王烈喜 陳黎斌 姚玉靜

摘要

[目的] 建立敏感、快速、特異的呋喃妥因代謝物海特因的檢測方法。[方法] 通過將間羧基苯甲醛和海特因的衍生物接種到牛血清白蛋白上免疫Balb/C小鼠，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，采用ELISA檢測海特因的鄰硝基苯甲醛衍生物。 [結(jié)果] 采用ELISA檢測海特因的鄰硝基苯甲醛衍生物，靈敏度達(dá)到0.1 ng/ml。制備的單克隆抗體具有特異性高、靈敏的優(yōu)點(diǎn)。[結(jié)論] 該研究可為酶聯(lián)免疫試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 呋喃妥因;海特因;單克隆抗體;交叉反應(yīng)

中圖分類號 Q819;S851.34+7 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A ?文章編號 0517-6611（2015）03-159-04

Study on the Detection Method of Nitrofurantoin Metabolite Aminohydantoin by Using Monoclonal Antibody

WANG Liexi， CHEN Libin， YAO Yujing

（Guangdong Food and Drug Vocational College， Guangzhou， Guangdong 510520）

Abstract [Objective] The research aimed to establish a sensitive， rapid and specific method of detecting nitrofurantoin metabolite aminohydantoin. [Method] The derivatives of 3carboxybenzaldehyde and aminohydantoin were inoculated with bovine serum albumin to immunize Balb/C mice. The monoclonal antibody was prepared by using hybridoma technique. The derivatives of 3carboxybenzaldehyde and aminohydantoin of aminohydantoin was detected by using ELISA. [Result] The The derivatives of 3carboxybenzaldehyde of aminohydantoin was detected by using ELISA， the sensitivity reached 0.1 ng/ml. The prepared monoclonal antibody had the advantages of high specificity and sensitivity. [Conclusion] The research could lay the foundation for the production of ELISA kits.

Key words Furantoin;Aminohydantoin; Monoclonal antibody; Cross reaction

基金項(xiàng)目 廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院校級項(xiàng)目（301009A1203）。

作者簡介

王烈喜（1981-），男，江西泰和人，講師，碩士，從事農(nóng)產(chǎn)品檢測研究。

收稿日期 20141209

硝基呋喃是人工合成的廣譜抗生素，由于價(jià)格低、效果好，曾被廣泛用于水產(chǎn)、獸禽的腸道傳染病的預(yù)防和治療^[1]。硝基呋喃主要包括4種化合物：呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林。呋喃妥因（Furantoin）又名呋喃坦啶（Furadantin），對大腸桿菌、金葡萄、表葡萄、腐生葡萄球菌和腸球菌屬均有抗菌作用^[2]。20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)硝基呋喃及其代謝物有致癌、致畸作用^[3]，世界各國開始禁止硝基呋喃的使用，1995年歐盟開始禁止硝基呋喃類藥物在畜禽及水產(chǎn)動(dòng)物食品中使用，并嚴(yán)格執(zhí)行對水產(chǎn)中硝基呋喃的殘留檢測，2002年美國亦隨之制定相應(yīng)法規(guī)。2002年我國農(nóng)業(yè)部第193號公告已經(jīng)將其列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》中。目前，世界各國食品監(jiān)督機(jī)構(gòu)所采用的標(biāo)準(zhǔn)是硝基呋喃類代謝產(chǎn)物不得檢出，檢測低限為1 μg/ml。

硝基呋喃進(jìn)入體內(nèi)后迅速代謝，難以檢測，而形成的代謝物與蛋白質(zhì)結(jié)合穩(wěn)定，可以保存數(shù)周^[4]。目前，國際上通行的方法是檢測動(dòng)物組織中的硝基呋喃代謝物殘留。呋喃唑酮（Furazolidone）、呋喃它酮（Furaltadone）、呋喃妥因（Nitrofurantoin）、呋喃西林（Nitrofurazone）的代謝產(chǎn)物分別為AOZ、AMOZ、AHD、SEM。為了建立敏感、快速、特異的呋喃妥因代謝物海特因的檢測方法，筆者通過將間羧基苯甲醛跟海特因的衍生物接種到牛血清白蛋白上免疫Balb/C小鼠，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，以期為酶聯(lián)免疫試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

呋喃妥因、海特因鹽酸鹽，購自山東方興科技有限公司;鄰硝基苯甲醛，購自Acros;間羧基苯甲醛購自Fluka;吡啶、二甲亞砜、乙酸乙酯、鹽酸、無水硫酸鈉、二甲基甲酰胺、碳酸氫鈉、四硼酸鈉、硼酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、Tween-20、碳酸鈉均購自深圳化試科技有限公司，均為分析純;N-甲基嗎啉和氯甲酸異丁酯均購自國藥集團(tuán);牛血清白蛋白、卵清蛋白、HEPES，均購自上海生工;RPMI 1640和胎牛血清為Gibco產(chǎn)品，購自廣州威佳科技有限公司;HT、HAT、福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑，均為Sigma產(chǎn)品，購自廣州寶泰克生物科技有限公司;呋喃唑酮的代謝物AOZ、均呋喃西林的代謝物SEM、呋喃它酮的代謝物AMOZ，均購自Sigma;Balb/c小鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0由南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)部免疫教研室惠贈(zèng);Costar酶標(biāo)板為Corning公司產(chǎn)品;羊抗鼠IgG-HRP、顯色劑購自晶美生物工程有限公司;SPA-Sepharose購自本元正陽基因技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、雷杜酶標(biāo)儀、雷杜洗板機(jī)、TGL-16C臺式高速離心機(jī)、TDL-40C低速離心機(jī)，紫外可見分光光度計(jì)、電子天平（感量1 mg）、 pH計(jì)（伏特pH510型，測量精度0.02）、移液槍（10～100 μl、20～200 μl、10～1 000 μl單道，300 μl八道）。

1.3 ?方法

1.3.1

間羧基苯甲醛與海特因衍生物（A）的制備。 ?50 mg間羧基苯甲醛，151 mg海特因鹽酸鹽，7 ml吡啶，加入25 ml圓底燒瓶中，回流過夜，蒸干吡啶，加入6 ml水，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至1～2，過濾收集沉淀，水洗，干燥，得到灰白色固體72 mg。MS為（M-H）-，246.1。

1.3.2

鄰硝基苯甲醛與海特因衍生物（B）的制備。

0.756 g 5 mmol 鄰硝基苯甲醛，溶于10 ml二甲亞砜，加入0.909 g 6 mmol海特因鹽酸鹽，室溫下攪拌5 h，然后加入60 ml 1 mol/L HCl，用2×50 ml乙酸乙酯提取，無水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑，得到1.14 g固體產(chǎn)物。MS： M+H+， 249.2; M+Na+， 271.3。

1.3.3

海特因衍生物A與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)。

采用混合酸酐法，上述制備的海特因衍生物A 18.6 mg，溶于1.8 ml二甲基甲酰胺，冰水冷卻下加入21 μl N-甲基嗎啡啉，18 μl氯甲酸異丁酯。冰水冷卻下反應(yīng)30 min。

稱取60 mg 牛血清白蛋白，溶于3 ml 0.1 mol/L，pH9.0的硼酸緩沖液，加入1.6 ml二甲基甲酰胺，滴加上述混合酸酐液1.2 ml，4 ℃下反應(yīng)過夜，對PBS透析2 d，換液6次，在波長200～360 nm處進(jìn)行紫外吸收掃描，-20 ℃凍存。

稱取30 mg 卵清蛋白，溶于1.5 ml 0.1 mol/L，pH9.0的硼酸緩沖液，加入0.8 ml二甲基甲酰胺，滴加上述混合酸酐液0.6 ml，4 ℃下反應(yīng)過夜，對PBS透析2 d，換液6次。離心去除反應(yīng)中生成的沉淀，在波長200～360 nm處進(jìn)行紫外吸收掃描，-20 ℃下凍存。

1.3.4

小鼠的免疫。海特因衍生物A與牛血清白蛋白的偶聯(lián)物稀釋成蛋白含量2 mg/ml，與福氏佐劑1∶1（v/v）用注射器乳化，每只小鼠皮下注射100 μl，第1次用福氏完全佐劑，然后再用福氏不完全佐劑。每隔3周加強(qiáng)免疫1次，共免疫5次。

1.3.5

小鼠滴度和抗體競爭試驗(yàn)。

取“1.3.3”中制備的卵清蛋白偶聯(lián)物，用包被緩沖液（0.05 mol/L碳酸緩沖液，pH9.5）稀釋2 000倍，加入酶標(biāo)板中，每孔100 μl，4 ℃包被過夜。倒去孔中液體，用洗滌液（0.05%Tween-20，10 mmol/L磷酸緩沖液，0.15 mol/L NaCl，pH7.4）配制的3%的脫脂奶粉37 ℃下封閉1 h，用洗滌液洗板5次。小鼠第5次免疫后12 d剪尾采血，血液37 ℃放置2 h，4 ℃過夜，離心分離血清。血清用洗滌液稀釋1 000倍、10 000倍等適當(dāng)倍數(shù)，加到上述包被的酶標(biāo)板中，每孔100 μl，37 ℃敷育40 min。洗板5次，加入羊抗鼠IgG-HRP，37 ℃敷育40 min，洗板5次，加入TMB底物100 μl，37 ℃下顯色15 min，加入終止液（2 mol/L硫酸）50 μl，使用酶標(biāo)儀測定450 nm的吸光值。

鄰硝基苯甲醛與海特因衍生物（B）對抗體的競爭試驗(yàn)，根據(jù)上述測定的滴度，取吸光值1.5左右的血清稀釋倍數(shù)，稀釋此倍數(shù)的一半，每孔加入50 μl血清稀釋液，50 μl B的溶液（B先用甲醇配成500 μg/ml，然后用洗滌液稀釋成0、0.2、2.0、20.0 μg/ml），同上進(jìn)行ELISA反應(yīng)，測定每個(gè)濃度對空白的抑制百分?jǐn)?shù)。

43卷3期 ? ? ? ? ? ? ?王烈喜等 利用單克隆抗體檢測呋喃妥因代謝物海特因方法的研究

1.3.6

細(xì)胞融合和單克隆抗體的制備^[5]。

取滴度高、競爭力好的2號鼠，融合前3 d尾靜脈注射50 μg免疫原，取脾跟骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，通過融合、ELISA篩選、有限稀釋法克隆，得到8株單克隆細(xì)胞株， 取細(xì)胞株的培養(yǎng)上清如上進(jìn)行滴度和競爭試驗(yàn)（鄰硝基苯甲醛海特因衍生物B配制成1、2和10 ng/ml），對篩選到克隆進(jìn)行凍存、復(fù)蘇，多次克隆試驗(yàn)，以檢驗(yàn)細(xì)胞株的穩(wěn)定性。

1.3.7

腹水的制備和單克隆抗體的純化。

取10只母Balb/c鼠，每只注射降值烷0.5 ml，7～14 d后注射單克隆細(xì)胞0.5 ?ml，含2×10⁶個(gè)細(xì)胞，7 d后適時(shí)處死小鼠，抽取腹水，離心去脂后-20 ℃凍存?？贵w用SPA-Sepharose純化，按照說明書進(jìn)行。

1.3.8

ELISA試劑盒條件的摸索。

取“1.3.3”制備的卵清蛋白偶聯(lián)物，用包被緩沖液稀釋1 000、2 000、4 000和8 000倍，加入Costar酶標(biāo)板中，每孔100 μl，4 ℃下包被過夜，第2天棄掉包被液，用含1%BSA 的洗滌液37 ℃封閉1 h， 洗板5次。板中加入1 mg/ml的單克隆抗體稀釋液，抗體用洗滌液稀釋1 000、2 000、4 000和8 000倍，用包被的板按照ELISA程序進(jìn)行Check board分析，選取光吸收值在1.5左右的組合，作為包被物和抗體的稀釋濃度。在此條件下制成的板，用適當(dāng)濃度的鄰硝基苯甲醛海特因衍生物進(jìn)行競爭試驗(yàn)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定試劑盒的靈敏度。

1.3.9

硝基呋喃代謝物的衍生。

硝基呋喃藥物呋喃唑酮代謝物AOZ、呋喃它酮代謝物AMOZ、呋喃妥因代謝物AHD、呋喃西林代謝物SEM用水溶解，配制成10 μg/ml，然后用水稀釋成適當(dāng)濃度。稱取鄰硝基苯甲醛15.1 mg，加入甲醇10 ml， 配制成10 mmol/L。1 ml硝基呋喃代謝物，加入4 ml水、0.25 ml 2 mol/L HCl和100 μl鄰硝基苯甲醛衍生化試劑，37 ℃過夜敷育。加入5 ml 0.1 mol/L K₂HPO₄，0.4 ml 1 mol/L NaOH，5 ml乙酸乙酯，振蕩1 min，取出2.5 ml乙酸乙酯，50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸干或氮?dú)獯蹈?，加? ml 0.01 mol/L PBS溶解，取50 μl進(jìn)行ELISA檢測，稀釋倍數(shù)為2。

1.3.10

交叉反應(yīng)試驗(yàn)。

與以上海特因鄰硝基苯甲醛的衍生物的競爭試驗(yàn)一樣，按照“1.3.8”中方法將AMOZ、AHD和SEM衍生，然后按照ELISA程序，將衍生物溶液加到已包被有卵清蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板孔中，每孔50 μl，稀釋抗體50 μl，經(jīng)過敷育、洗滌、加入二抗、洗滌、顯色等步驟，計(jì)算出與空白相比抑制吸收值50%的IC₅₀，利用海特因的IC₅₀，計(jì)算出它們的交叉反應(yīng)性CR值（海特因鄰硝基苯甲醛的衍生物IC₅₀/測試的物質(zhì)的IC₅₀×100）。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫原的制備

由于呋喃妥因的代謝物海特因（AHD）的分子量很小，不太適宜作為半抗原，進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)背景噪音較大。檢測硝基呋喃代謝物一般先使鄰硝基苯甲醛和海特因反應(yīng)，然后檢測它們的衍生物^[6]（圖1）。鄰硝基苯甲醛海特因衍生物沒有可以直接跟蛋白質(zhì)連接的基團(tuán)，

圖1 鄰硝基苯甲醛和海特因的衍生物

筆者先用間羧基苯甲醛跟海特因在吡啶中結(jié)合（圖2），制作分子結(jié)構(gòu)類似物^[7]。經(jīng)過質(zhì)譜鑒定得到間羧基苯甲醛跟海特因的衍生物（圖3）。利用混合酸酐法，將它的羧基與牛血清白蛋白的氨基相聯(lián)制備免疫原，與卵清蛋白相聯(lián)制備篩選抗原。從紫外吸收光譜上可以看出，蛋白偶聯(lián)前后發(fā)生了很大變化（圖4）。

圖2 蛋白與AHD的偶合物的合成

2.2 ?單克隆的制備

小鼠免疫5次后，用間羧基苯甲醛海特因衍生物A與OVA的偶聯(lián)物稀釋2000倍包被酶標(biāo)板，測定其滴度。

根據(jù)上面的滴度參數(shù)，以1、2號鼠的血清稀釋50 000

倍，3、4、5號鼠的血清稀釋25 000倍，進(jìn)行鄰硝基苯甲醛海特因衍生物B的競爭試驗(yàn)。

表1 間羧基苯甲醛海特因衍生物A與OVA的偶聯(lián)物包被酶標(biāo)板測定結(jié)果

鼠號血清稀釋下列倍數(shù)的ELISA光吸收

10 00050 000100 000200 000

11.7761.6261.4750.144

21.7291.7171.5240.832

31.7351.4270.7540.102

41.6951.3550.6940.098

51.7701.2440.5660.096

從表2可以看出，加入鄰硝基苯甲醛海特因后，抑制了抗體跟酶標(biāo)板上的偶聯(lián)物的結(jié)合，證明抗體能跟鄰硝基苯甲醛海特因結(jié)合。選取滴度高、競爭相對較好的2號鼠進(jìn)行融合，融合后得到8個(gè)滴度高的克隆A001～A008（表3）。

注：A.羧基苯甲醛與海特因的衍生物;B.鄰硝基苯甲醛和海特因的衍生物。

圖3 AHD衍生物的質(zhì)譜碎片分析

圖4 紫外吸收光譜

表2 鄰硝基苯甲醛海特因衍生物B的競爭試驗(yàn)結(jié)果

鼠號鄰硝基苯甲醛海特因衍生物的濃度∥μg/ml

00.22.020.0

11.4421.0380.5700.098

21.5170.9120.3650.079

31.3471.1200.5330.230

41.2781.1100.6420.154

51.1590.8770.4120.122

選取7號克隆，小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，7 d后適當(dāng)時(shí)間收集腹水，用SPA親和層析柱純化，所得抗體用來制備酶聯(lián)免疫試劑盒。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用間接法，在酶標(biāo)板上包被海特因衍生

表3 ? 小鼠融合后克隆競爭試驗(yàn)結(jié)果

克隆號培養(yǎng)上清

稀釋倍數(shù)鄰硝基苯甲醛海特因衍

生物的濃度∥ng/ml

020

14001.2350.332

24001.6540.454

34000.9870.244

48001.2210.772

54001.3350.423

68001.0520.234

78001.3440.098

84001.4430.655

物的卵清蛋白偶聯(lián)物，加入抗體、不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液或者樣品敷育，洗板后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG。經(jīng)洗滌，加

底物顯色后，2 mol/L硫酸終止，測定450 nm處光吸收值。利用Check board法，確定最適包被偶聯(lián)物和抗體的濃度，以百分吸光度對AHD濃度的對數(shù)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5），其中百分吸光度值的計(jì)算公式如下：

百分吸光度值（%）=（B/B0）×100

式中，B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值;B0為0 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。

圖5 呋喃妥因代謝物的酶免疫試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 ?交叉反應(yīng)性

1個(gè)好的抗體要求其特異性要好。測定了A007號抗體和呋喃唑酮的代謝物AOZ、呋喃它酮的代謝物AMOZ、呋喃西林的代謝物SEM的交叉反應(yīng)性，先將代謝物用鄰硝基苯甲醛進(jìn)行衍生，然后測定半數(shù)抑制濃度IC₅₀，發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)性均少于0.1%（表4）。

表4 ?抗體與呋喃妥因及其他硝基呋喃代謝物的交叉反應(yīng)

品名IC₅₀∥ng/ml交叉反應(yīng)性（CR，%）

海特因0.9100

AOZ>1 000<0.1

AMOZ>1 000<0.1

SEM>1 000<0.1

3 ?討論

作為完全抗原其分子結(jié)構(gòu)上需要同時(shí)具備T細(xì)胞和B

細(xì)胞表位，小分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)簡單，難以同時(shí)具有這2種表位，需先將它接種到載體蛋白上，借助載體蛋白的T細(xì)胞表位間接誘導(dǎo)B細(xì)胞的活化、增值，才能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對小分子半抗原的抗體。常用的載體蛋白有銅藍(lán)蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、結(jié)核桿菌毒素蛋白和人工合成的多抗原肽系統(tǒng)。

蛋白質(zhì)上常用來連接小分子的基團(tuán)有氨基、羧基、巰基、酪氨酸的苯環(huán)等。小分子與蛋白質(zhì)相連的位置、臂長等直接影響抗體對小分子的親合力。鄰硝基苯甲醛和海特因的衍生物沒有直接連接到蛋白質(zhì)上的基團(tuán)，利用間羧基苯甲醛與海特因的衍生物上的羧基跟蛋白質(zhì)上的氨基相連，雖然苯環(huán)上少了1個(gè)硝基，多了1個(gè)羧基，但作出的抗體跟鄰硝基苯甲醛和海特因的衍生物仍有很強(qiáng)的親和力。ELISA檢測結(jié)果可以精確到0.1 ng/ml。

單克隆抗體具有結(jié)構(gòu)均一、重復(fù)性好、細(xì)胞株可以冷凍保存、易于生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。該研究制備的單抗具有特異性高、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，可為開發(fā)ELISA酶聯(lián)檢測試劑盒以及方便、快速檢測呋喃妥因殘留奠定了基礎(chǔ)。

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