孫江濤（通訊作者） 肖中岳 宋開放

【摘 要】 目的：研究賁門癌組織中CD133蛋白表達(dá)及其與幽門螺桿菌（H.pylori，HP）感染的關(guān)系。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)62例賁門癌手術(shù)切標(biāo)本及41例癌旁正常組織中CD133蛋白的表達(dá)，采用改良Giemsa染色法檢測(cè)103例標(biāo)本中HP感染情況，分析CD133蛋白表達(dá)在賁門癌發(fā)生中的作用及其與HP感染的關(guān)系。結(jié)果：62例賁門癌組織中有30（48.4%）例出現(xiàn)CD133蛋白陽(yáng)性表達(dá)，而41例癌旁正常組織中僅有11例（26.8%）出現(xiàn)CD133蛋白陽(yáng)性表達(dá)（P=0.023）。在有HP感染標(biāo)本中CD133表達(dá)率為65.8%（50/76），而在沒有HP感染標(biāo)本中CD133表達(dá)率為25.9%（7/27）。經(jīng)Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，CD133表達(dá)與幽門螺桿菌感染呈正相關(guān)（r=0.655，P<0.001）。結(jié)論：CD133蛋白參與了賁門癌的發(fā)生發(fā)展，且與幽門螺桿菌感染密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】CD133蛋白；幽門螺桿菌感染；賁門癌

1 引言

由幽門螺桿菌感染（H.pylori，HP）引起的慢性炎癥被公認(rèn)為賁門癌發(fā)生的重要原因。這些慢性炎癥會(huì)導(dǎo)致胃粘膜反復(fù)的損傷與修復(fù)，從而導(dǎo)致賁門粘膜過(guò)度增生，有絲分裂錯(cuò)誤的概率增加，進(jìn)而導(dǎo)致賁門癌的發(fā)生。近期研究發(fā)現(xiàn)，這些能夠?qū)е沦S門癌發(fā)生的炎癥環(huán)境與周圍組織骨髓衍生細(xì)胞（bone marrow-derived cells，BMDCs）的引導(dǎo)和植入相關(guān)[1-2]。而BMDCs表面抗原標(biāo)志物CD133更是是目前各種腫瘤研究的熱點(diǎn)標(biāo)志物之一。CD133蛋白已在近期的研究中被證實(shí)與大腸癌，腦膠質(zhì)瘤和肝癌的發(fā)生有關(guān)[3-5]。但調(diào)控其表達(dá)原因尚不明確。本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)測(cè)定賁門癌及癌旁正常組織中CD133的表達(dá)情況，采用改良Giemsa染色法檢測(cè)103例標(biāo)本中幽門螺桿菌感染情況，探討CD133表達(dá)與賁門癌發(fā)生的關(guān)系及其與幽門螺桿菌（H.pylori，HP）感染的關(guān)系.

2 材料和方法

2.1 材料

隨機(jī)選取我院腫瘤外科近一年來(lái)賁門癌術(shù)后男51例女11例共62例標(biāo)本，同時(shí)選取41例癌旁組織（標(biāo)準(zhǔn)為距癌緣大于5cm并經(jīng)組織學(xué)證實(shí)為正常組織）。所有組織用10%甲醛溶液固定，連續(xù)切片3張（厚度4μm），第一張行HE染色；第二張免疫組化染色，第三張備用。患者均為首次發(fā)現(xiàn)賁門癌，術(shù)前未經(jīng)過(guò)放化療。據(jù)2003年國(guó)際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)病理TNM分期，Ⅰ期21例，Ⅱ期19例，Ⅲ期15例，Ⅳ期7例。

2.2 方法

2.2.1 試劑：一抗，鼠抗人CD133單克隆抗體，購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotec公司PV9000免疫組化試劑盒購(gòu)北京中杉金橋公司，Giemsa染料購(gòu)自上海三愛思公司。

2.2.2免疫組化：嚴(yán)格按照PV9000試劑盒操作步驟進(jìn)行。常規(guī)脫蠟、梯度乙醇水化，抗原采用微波熱修復(fù)，滴加一抗后4°保存>12小時(shí)。3% H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗顯色，蘇木精復(fù)染，樹脂封片

2.2.3 HP檢測(cè)：采用改良Giemsa染色法，常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化，2% Giemsa染液染色25 min，洗去染液，使用乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2.3 結(jié)果判定

判定采用雙盲法進(jìn)行，兩位病理專家同時(shí)、獨(dú)立閱片，有差異者進(jìn)行共同閱片后判定。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：陽(yáng)性細(xì)胞位于腺腔，定位于胞膜，染色呈金黃色。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占病變細(xì)胞的百分比分為3個(gè)等級(jí)：1%～25%為（+），26%～50%為（++），>50%為（+++）。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包統(tǒng)計(jì)分析本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。賁門癌和癌旁正常組織中CD133的表達(dá)差異分析采用χ2檢驗(yàn)或者Fisher確切概率法，CD133的表達(dá)與HP感染的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析

3 結(jié)果

3.1 CD133蛋白在賁門癌與癌旁正常組織中的表達(dá)情況。

CD133蛋白陽(yáng)性表達(dá)定位于腺腔細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，62例賁門癌組織中共檢測(cè)出CD133蛋白陽(yáng)性表達(dá)30例（48.4%），呈金黃色，著色明顯。41例癌旁正常組織CD133蛋白陽(yáng)性表達(dá)11例（26.8%），呈淡黃色，著色較輕。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CD133蛋白在兩組之間的表達(dá)具有明顯差異（P=0.023）。（見圖1）

圖1 CD133蛋白在賁門癌及癌旁組織中的表達(dá)

A：癌旁組織中CD133 的表達(dá) B：賁門癌組織中CD133的表達(dá)（SP×200）

3.2 CD133蛋白表達(dá)與HP感染的關(guān)系。

在103例標(biāo)本中共檢出HP感染76例，其CD133陽(yáng)性表達(dá)率為65.8%（50/76），而在沒有HP感染的27例標(biāo)本中CD133表達(dá)率為僅為25.9%。經(jīng)Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，CD133表達(dá)與幽門螺桿菌感染呈正相關(guān)（r=0.655，P<0.001）。（見表1）

表1 CD133蛋白表達(dá)與HP感染的關(guān)系

組別 n 有幽門螺桿菌感染 無(wú)幽門螺桿菌感染 P值

CD133+ CD133- 陽(yáng)性率

（%） CD133+ CD133- 陽(yáng)性率

（%）

賁門癌 62 31 15 67.39 5 11 31.25 0.011

癌旁正常組織 41 19 11 63.33 2 9 18.18 0.012

4 討論

已有研究證實(shí)，BMDCs在賁門癌的發(fā)生中起著重要作用，而由HP感染引起的長(zhǎng)期慢性炎性反應(yīng)對(duì)BMDCs具有募集作用。CD133被認(rèn)為是包括造血干細(xì)胞在內(nèi)的BMDCs的有效標(biāo)記物[5-7]。CD133被認(rèn)為是包括造血干細(xì)胞在內(nèi)的BMDCs的有效標(biāo)記物[8-10]。CD133即Homo sapiens prominin 1（PROM1），由位于人類4號(hào)染色體（4p15.32）的編碼基因（GeneID：8842）編碼，其轉(zhuǎn)錄蛋白（CD133蛋白）分子量為120KD，具有5個(gè)跨膜區(qū)[11]。最近研究顯示，CD133蛋白與大腸癌[3]，腦膠質(zhì)瘤[4]，和肝癌[5]的發(fā)生有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，CD133蛋白在賁門癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為48.4%，高于癌旁正常組織26.8%（P=0.023），也提示CD133蛋白有可能參與了賁門癌的發(fā)生。Seiji Futagami等[12]在最近的研究中意外發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期感染HP的沙鼠出現(xiàn)CD133陽(yáng)性細(xì)胞的概率明顯高于短期感染的沙鼠，且CCR2的表達(dá)與CD133陽(yáng)性細(xì)胞的出現(xiàn)密切相關(guān)。由此我們推測(cè)CD133蛋白的表達(dá)與HP感染有關(guān)。而在本研究中，經(jīng)HP感染的76例標(biāo)本中，CD133陽(yáng)性率為65.8%（50/76），沒有HP感染的27例標(biāo)本中CD133陽(yáng)性率僅為25.9%。經(jīng)Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，CD133表達(dá)與HP感染呈高度正相關(guān)。據(jù)此我們推測(cè)，HP感染是導(dǎo)致CD133蛋白異常表達(dá)的重要原因。

綜上所述，賁門癌組織中CD133蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，H.pylori感染可以誘導(dǎo)CD133蛋白的表達(dá)，且這種異常表達(dá)在賁門癌的發(fā)生中起重要作用。而HP感染引起CD133蛋白表達(dá)的分子機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究。

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通訊作者：

孫江濤，男，1971年12月，碩士研究生，副教授，主要從事胸部腫瘤的手術(shù)及綜合治療。