孫慶喜 李丕學(xué)

摘要：目的： 探討膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在膠質(zhì)瘤的生成和復(fù)發(fā)過程中的作用。方法： 在本研究中我們通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)三氧化二砷（As2O3）對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有抑制作用，利用免疫熒光技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)，檢測三個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（U87MG，U251MG和U373MG）被As2O3處理72h后Nestin蛋白表達(dá)變化；利用軟膠懸浮培養(yǎng)技術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞系神經(jīng)球形成變化；利用免疫缺陷鼠檢測腫瘤移植物生成變化；利用Western印記分析檢測腫瘤細(xì)胞系Notch1和Hes1蛋白表達(dá)變化。結(jié)果： As2O3（2μM）能將膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG、U251MG和U373MG中的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分別減少12%、14%和7%，抑制腫瘤移植物在免疫缺陷鼠中生成和U87MG細(xì)胞系生成神經(jīng)球，通過免疫印跡分析我們發(fā)現(xiàn)伴隨膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的抑制Notch1和Hes1蛋白減少。結(jié)論： As2O3對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有明顯的抑制作用，其機(jī)制為Notch途徑活性的下調(diào)。

關(guān)鍵詞：膠質(zhì)瘤；癌干細(xì)胞；三氧化二砷

膠質(zhì)瘤對(duì)放化療具有抵制作用，所以極易復(fù)發(fā)。然而，通過對(duì)治療抵制機(jī)制的研究，一小群膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在此過程中發(fā)揮重要作用，從而使膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)率明顯下降[1，2]。全新的針對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的治療方案受到廣泛關(guān)注。盡管最近一些報(bào)道稱膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)放化療具有抵制作用，但是，通過對(duì)信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)一些藥物已經(jīng)表現(xiàn)出對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有抑制作用[3，4]。例如，cyclopamine通過阻斷Hedgehog信號(hào)通路能減少膠質(zhì)瘤干細(xì)胞[5]。

在本研究中我們檢測了As2O3抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的作用。我們的結(jié)論是低劑量的As2O3即能抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖。同時(shí)，我們也分析了可能的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路的下調(diào)是As2O3抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖的重要機(jī)制。我們的數(shù)據(jù)證實(shí)As2O3通過下調(diào)Notch信號(hào)通路能抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖。

材料和方法

1.藥物

As2O3來自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，應(yīng)用PBS將As2O3稀釋成五個(gè)不同濃度（1，2，4，8和16μM）用于體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)。

2.細(xì)胞培養(yǎng)

U87MG，U251MG和U373MG三個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系被培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM中。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)（CT02，CHEMICON）檢測As2O3對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果。使用MTT法對(duì)細(xì)胞增殖分析進(jìn)行評(píng)估[20]。簡單地說，每孔含有100μl培養(yǎng)基的96孔板中加入1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)4h后加入各種濃度的As2O3，然后培養(yǎng)24-72h吸除培養(yǎng)液加入WST-8（四唑氮鹽），在37℃條件下培養(yǎng)30分鐘后，應(yīng)用分光光度儀在570nm波長下測量每個(gè)孔的吸光光度值，吸光光度值與細(xì)胞數(shù)量相對(duì)應(yīng)并不受As2O3的影響，以對(duì)照孔為基礎(chǔ)計(jì)算細(xì)胞的增值率，繪制劑量依賴性曲線和計(jì)算半數(shù)致死劑量，實(shí)驗(yàn)被重復(fù)三次。

3.流式細(xì)胞儀

三個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（U87MG，U251MG和U373MG）被As2O3處理72h后，應(yīng)用Nestin-FITC抗體（R&D System），根據(jù)產(chǎn)品說明書做染色，染色后的細(xì)胞應(yīng)用FACS （BD Cor.）進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用WinMDI 2.87分析，結(jié)果應(yīng)用ModFit LT 3.1（Verity）證實(shí)。

4.免疫熒光染色

培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)2μM和4μM As2O3 處理72h后，應(yīng)用4%的多聚甲醛固定15分鐘，0.2% Triton X-100透化10分鐘，蛋白阻斷劑（Thermo）培養(yǎng)5分鐘，1：200稀釋的Nestin 單克隆抗體（MAB5326， CHEMICON）4℃過夜，1：20稀釋的FITC二抗（DakoCytomation） 室溫1h，最后應(yīng)用DAPI（Sigma）染色，被標(biāo)記的細(xì)胞應(yīng)用共聚焦顯微鏡分析。

在凋亡的實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞被2μM和4μM As2O3 處理24h，應(yīng)用鼠的Nestin單克隆抗體（CHEMICON）和兔的Caspase-3多克隆抗體（CHEMICON），二抗分別為FITC （CHEMICON） 和PE（Sigma）。

結(jié) 果

1. As2O3抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖

為了確定As2O3是否能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，我們檢測了它對(duì)U87MG、U251MG和U373MG三個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系抑制效果。這些細(xì)胞被1、2、4、8和16μM As2O3處理72h，應(yīng)用MTT法揭示了As2O3的劑量依賴性抑制效果。依據(jù)細(xì)胞系的不同其對(duì)As2O3的敏感度也不同，半數(shù)致死劑量分別為1.9、2.4和3.0μM（Fig.1）。這些結(jié)果展示了As2O3能在體外有效地抑制這三種細(xì)胞的增殖，接近半數(shù)致死劑量（2μM和4μM）的As2O3被用于余下的實(shí)驗(yàn)。

2.As2O3能減少Nestin（+）膠質(zhì)瘤細(xì)胞的百分率

在U87MG、U251MG和U373MG三個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，Nestin（+）細(xì)胞的百分率分別為89%、88%和98%（Fig.2）。根據(jù)流式細(xì)胞儀和免疫染色的結(jié)果，經(jīng)不同濃度As2O3（2、4、8和16μM ）處理后Nestin（+）腫瘤細(xì)胞的百分率明顯下降。代表膠質(zhì)瘤干細(xì)Nestin（+）細(xì)胞在U87MG腫瘤細(xì)胞系中由89%分別下降到78%（2μM ）和68%（4μM），同樣，U251MG由88%下降到76%和64%，U373MG由98%下降到91%和58%。這些結(jié)果都說明，在這三個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中As2O3能減少Nestin（+）腫瘤細(xì)胞，也就是說As2O3能抑制這三個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的增殖，這些結(jié)果也促使我去探尋As2O3抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的機(jī)制。

3.神經(jīng)球形成分析

接下來我們檢測了As2O3在體外抑制腫瘤生成的效果。首先，通過克隆形成分析我們檢測了U87MG是否能形成孤立的神經(jīng)克隆，然后，將U87MG細(xì)胞喂養(yǎng)在含軟膠培養(yǎng)皿中，平均每個(gè)視野下可形成41個(gè)神經(jīng)克?。‵ig.3），同樣數(shù)量經(jīng)2μM和4μMAs2O3處理后的活細(xì)胞在同樣軟膠培養(yǎng)條件下，形成神經(jīng)克隆的數(shù)量分別為21個(gè)和5個(gè)，8μM As2O3能更加明顯地減少神經(jīng)克隆的形成。

4.腫瘤移植物形成分析

為了確定As2O3對(duì)腫瘤移植物形成的影響，三個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（U87MG、U251MG和U373MG）被As2O3（2μM和4μM）處理72h后，應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)有活力的細(xì)胞，每組50萬個(gè)有活力的細(xì)胞被注入裸鼠皮下，再對(duì)照側(cè)有大的腫瘤移植物形成，相反，在處理組側(cè)僅有較小或沒有腫瘤移植物形成（Fig.4）。這些結(jié)果說明U87MG、U251MG和U373MG細(xì)胞的腫瘤形成能力可被低濃度的As2O3所抑制。

討 論

最近，與腫瘤起源和生存相關(guān)的癌癥干細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤的發(fā)生和復(fù)發(fā)的重要原因[2]。而且，一些報(bào)道稱這些細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)的放化療具有抵制作用[3，4]。因此，尋找有效的治療策略成為研究的熱點(diǎn)。低劑量的As2O3能使急性早幼粒細(xì)胞白血病患者得到完全緩解[15]，抑制APL干細(xì)胞增殖[17]，所以，As2O3被認(rèn)為能去除APL中的癌癥干細(xì)胞。然而，As2O3是否能去除膠質(zhì)瘤中的癌癥干細(xì)胞仍是未知。在本研究中我們檢測了As2O3對(duì)U87MG、U251MG和U373MG三種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的抑制效果，發(fā)現(xiàn)，在體外低劑量的As2O3能抑制Nestin（+）細(xì)胞的增殖，而且，能明顯抑制腫瘤克隆的形成，同時(shí)有效地抑制腫瘤移植物在裸鼠體內(nèi)的形成。本實(shí)驗(yàn)第一次說明了As2O3能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的癌癥干細(xì)胞。同時(shí)，我們觀察到經(jīng)As2O3處理的腫瘤細(xì)胞中Notch1和Hes1蛋白明顯下降，說明Notch信號(hào)通路的下調(diào)參與了As2O3對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的抑制過程，這些結(jié)果都說明As2O3能克服化療抵制對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞發(fā)揮抑制作用。

在體內(nèi)和體外低濃度的As2O3都能抑制U87MG、U251MG和U373MG細(xì)胞的增殖說明，此藥物可以被考慮進(jìn)行進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以能真正用于臨床治療膠質(zhì)瘤患者。而且，本研究第一次說明了As2O3誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞抑制的機(jī)制。下一步實(shí)驗(yàn)我們將證實(shí)其它機(jī)制的存在，例如Notch信號(hào)通路與其它信號(hào)通路之間的相互作用以及As2O3誘導(dǎo)的自噬。

總之，As2O3誘導(dǎo)的Notch信號(hào)通路阻滯抑制了膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖，因此，As2O3能有效地抑制膠質(zhì)瘤的生長。這個(gè)結(jié)論為進(jìn)一步研究As2O3在臨床上治療膠質(zhì)瘤提供了理論基礎(chǔ)。

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