張晶鑫 高玉時 樊艷鳳 唐修君 賈曉旭 顧榮 陸俊賢

摘要 [目的] 建立一種快速準確的鴨源性成分檢測方法。[方法]分別以線粒體16S rRNA 基因和COⅠ基因序列為靶位點設(shè)計鴨特異性引物，以常見畜禽肉（羊肉、牛肉、豬肉、兔肉、鴿肉、鵪鶉肉、雞肉、鴨肉、鵝肉）DNA為模板，進行PCR擴增，檢測引物的特異性和靈敏度。[結(jié)果]篩選的引物能夠有效地對鴨源性成分進行檢測，方便簡潔，靈敏度較高。[結(jié)論]該方法能夠快速有效地鑒別畜禽肉中鴨源性成分。

關(guān)鍵詞 鴨源性成分；16S rRNA 基因；COⅠ基因；PCR；鑒別

中圖分類號 S879.2；TS251.5 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）34-202-02

近年來，動物源性食品摻雜摻假等各種食品安全事件頻發(fā)。在西方，一項對近千種肉制品的檢測分析表明，有近20%的產(chǎn)品存在標識與品種不完全相符的現(xiàn)象[1]。研究動物源性食品安全檢測技術(shù)，對食品動物源性成分進行鑒定，顯得尤為重要。

PCR技術(shù)由于其操作簡便、快速高效等特點，已在國內(nèi)外肉類摻假研究中得到廣泛應(yīng)用，并取得創(chuàng)新性成果[2-4]，目前已成為肉制品品種鑒別最常用的方法之一。動物線粒體基因組DNA序列具有高度的物種特異性，是設(shè)計肉類成分定性檢測的首選靶點，包括細胞色素b（Cyt b）基因、12S rRNA、16S rRNA、DLoop基因等[5-7]。

筆者選擇16S rRNA基因和COⅠ基因序列為目標基因，通過基因序列比對，設(shè)計篩選出鴨特異性引物，以羊肉、牛肉、豬肉、兔肉、鴿肉、鵪鶉肉、雞肉、鴨肉、鵝肉9種動物DNA為模板，建立運用PCR技術(shù)鑒別畜禽肉中鴨源性成分快速鑒別方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 以市售合格的牛、羊、豬、兔、鴿、鵪鶉、雞、鴨及鵝肉為試驗素材，各物種肉樣充分攪碎混勻，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取。

采用離心柱式組織基因組DNA小量抽提試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取DNA。提取的總DNA樣品溶于100 μl洗脫液TE中，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計與合成。

根據(jù)GenBank公布的鴨線粒體DNA（登錄號為KJ833587）16S rRNA基因和COⅠ基因序列，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計篩選特異性引物對，并送至上海生工生物工程有限公司合成。取適量引物用高壓滅菌后的超純水溶解，配制成10 μmol/L的儲備液。引物序列、Tm值與擴增片段大小見表1。

1.2.3 PCR擴增。20 μl PCR擴增體系：2×Tag Master Mix （南京博爾迪公司）10 μl，10 μmol/L引物各0.3 μl，模板1 μl，ddH2O 8.4 μl。

反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸60 s，共28個循環(huán)；最后72 ℃延伸4 min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物檢測和測序 。

PCR反應(yīng)完畢后將產(chǎn)物取出，利用1.5%瓊脂糖（Promega公司）凝膠電泳檢測，并割膠回收純化，交由上海華大公司進行測序，所有序列采用雙向測序，以便比對核實，測序結(jié)果與GenBank上已知序列進行比對。

1.2.5 靈敏度試驗。

將鴨肉DNA模板按梯度進行稀釋，分別稀釋10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍，觀察該方法靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體DNA 16S rRNA和COI基因PCR特異性檢測

將PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與GenBank 上已知序列進行比對，結(jié)果顯示，鴨的測序結(jié)果與已發(fā)表序列（GenBank登錄號分別為KJ833587.1、KJ833586.1）的同源性均在99%以上，與預(yù)期基本一致，確定為鴨肉成分。

以羊肉、牛肉、豬肉、兔肉、鴿肉、鵪鶉肉、雞肉、鴨肉、鵝肉9種動物肌肉DNA為模板，分別對所設(shè)計篩選的鴨引物進行特異性研究。根據(jù)鴨線粒體16S rRNA設(shè)計的引物，只有鴨的DNA模板能擴增出222 bp的目的條帶（圖1）；利用鴨線粒體COⅠ基因設(shè)計的引物，只有鴨的DNA模板能擴增出96 bp的目的條帶（圖2）。

3 討論

肉與肉制品摻雜、摻假是目前食品質(zhì)量控制面臨的重要挑戰(zhàn)。一些不法商家或個人為了追求自身利益以低價劣質(zhì)的肉冒充高價優(yōu)質(zhì)的肉，嚴重侵犯了消費者合法權(quán)益。對食品中原料肉進行摻假、摻雜檢驗勢在必行，其重點是快速、準確地鑒定肉品成分來源。

近年來，PCR技術(shù)已逐步成為肉類種屬鑒定的核心方法[8-9]。何瑋玲等[10]基于動物線粒體細胞色素b基因的差異性位點，建立并優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系，實現(xiàn)4種肉類（豬肉、牛肉、羊肉和雞肉）的快速鑒別。Soares等[11]應(yīng)用雙重PCR在豬肉中成功檢測到禽肉。Ghovvati等[12]基于線粒體12S rRNA和16S rRNA基因應(yīng)用多重PCR技術(shù)對反芻動物、家禽和豬進行鑒別。陳冬等[2] 基于牛線粒體12S rRNA基因，設(shè)計通用引物，成功用于混合鮮牛肉及制品中牛種來源鑒別。

該研究主要根據(jù)鴨線粒體基因組編碼基因16S rRNA基因和COⅠ基因序列的位點差異設(shè)計特異性引物，進行PCR擴增檢測，對包括羊、牛、豬、雞、兔、鴿、鵪鶉、鴨、鵝9種動物在內(nèi)的畜禽肉進行動物源性鑒別，經(jīng)過多次重復(fù)試驗證明，所選定的鴨引物對只有在鴨DNA模板存在的情況下才會發(fā)生PCR擴增，檢測靈敏度較高，16S rRNA基因靈敏度達1.98×10-2ng/ul，COⅠ基因靈敏度達1.98×10-1ng/ul，建立了快速、準確的畜禽肉中鴨源性成分PCR鑒別方法。在下一步工作中，將開展16S rRNA和COⅠ基因序列熒光定量PCR技術(shù)，進一步研發(fā)食品中動物源性成分分析方法，為保障肉類產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展、維護市場秩序提供有效保障。

參考文獻

[1]

BALLIN N Z， VOGENSEN F K， KARLSSON A H.Species determinationcan we detect and quantify meat adulteration？[J]. Meat science， 2009， 83（2）： 165-174.

[2] 陳冬，柏凡，周明亮，等.基于線粒體12S rRNA基因鑒別混合牛肉及制品的牛種來源[J].遺傳，2008，30（8）：1008-1014.

[3] YIN R H， BAI W L， WANG J M， et al. Development of an assay for rapid identification of meat from yak and cattle using polymerase chain reaction technique[J]. Meat science， 2009， 83（1）： 38-44.