李曉慶 富堯 陳光道 韓曉玥 常江春 羅志文 許龍

摘要[目的] 優(yōu)化木瓜蛋白酶提取美洲大蠊多糖的工藝參數(shù)。 [方法]利用不同梯度木瓜蛋白酶對美洲大蠊進行蜚蠊多糖提取試驗，采用單因素和正交試驗的方法，考察最佳酶用量、提取時間、溫度等相關(guān)參數(shù)對提取液中多糖的含量的影響，確定蜚蠊多糖提取的工藝。[結(jié)果]試驗表明，蜚蠊多糖提取的最佳條件為：酶用量為300 μg/g，提取溫度60 ℃，提取時間1.0 h。[結(jié)論] 研究可為建立高效、實用的蜚蠊多糖提取途徑提供技術(shù)參考，同時也為美洲大蠊的保健藥品及功能性食品開發(fā)提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞蜚蠊多糖；酶解法；提取工藝；條件優(yōu)化

中圖分類號TS218文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2015）34-081-03

美洲大蠊（Periplaneta americana L.），為昆蟲有翅亞綱蜚蠊目大蠊屬昆蟲，俗稱“蟑螂”，也稱其為石姜、滑蟲，各地方都有其不同的俗名，如偷油婆、茶婆子、灶螞子等[1]。在《本草綱目拾遺》中，蟑螂作為俗名首次出現(xiàn)。蟑螂作為藥用昆蟲最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為中品，味咸、寒，可治療寒熱癥、破積聚、喉咽閉、體寒無子等病癥。在歷代重要本草典籍如《新修本草》、《本草綱目》中都有記載，近代許多藥學(xué)專著中也有記述[2]。從美洲大蠊的研究文獻來看，目前國內(nèi)的研究主要集中在美洲大蠊的種群調(diào)查、分布、發(fā)生規(guī)律及防治技術(shù)，包括不同種類殺蟲劑對美洲大蠊殺滅效率的比較與殺滅機理的研究；基因表達和致敏作用方面的研究；藥用價值開發(fā)的研究[3-5]等。

筆者采用木瓜蛋白酶水解法對美洲大蠊中的蜚蠊進行多糖提取試驗，優(yōu)化其多糖的提取工藝，為建立高效、實用的蜚蠊多糖提取途徑提供技術(shù)參考。研究采用了苯酚-硫酸法測定蜚蠊多糖的含量，對比不同提取條件多糖的提取率，為后續(xù)美洲大蠊的保健藥品及功能性食品開發(fā)提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料美洲大蠊藥材郵購自河北省安國中藥材大市場，經(jīng)佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院羅志文副教授鑒定為蜚蠊目鱉蠊科美洲大蠊，原藥材及樣品現(xiàn)保存于佳木斯大學(xué)應(yīng)用昆蟲研究所。

1.2樣品預(yù)處理

采用精細中藥粉碎機對干燥后的美洲大蠊原藥材進行粉碎，粉碎后過40目篩，放于55 ℃恒溫箱內(nèi)干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

預(yù)處理是采用石油醚除去脂溶性雜質(zhì)，按照原料∶石油醚=1∶3（W/V）的量加入石油醚，室溫下浸泡10 h后，抽濾，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮回收石油醚，重復(fù)2次，于50 ℃干燥后保存?zhèn)溆肹6]。

1.3試驗方案

稱取處理過的美洲大蠊粉末各5 g，按試驗設(shè)定的木瓜蛋白酶用量、提取溫度、提取時間在恒溫水浴鍋內(nèi)進行美洲大蠊的多糖提取，試驗完成后，迅速將提取液升溫至100 ℃對酶滅活5 min，抽濾，并用50 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，濃縮液加入3倍量的95 %乙醇在4 ℃冰箱內(nèi)醇沉24 h，采用大容量低速離心機離心10 min，沉淀物用無水乙醇洗滌脫水2次，低溫干燥得到蜚蠊多糖[7]。

1.3.1蜚蠊多糖提取工藝的單因素試驗。

對美洲大蠊提取多糖進行單因素試驗，包括木瓜蛋白酶用量、提取時間、提取溫度，試驗因素水平范圍分別為：木瓜蛋白酶用量（A）為100～600 μg/g；提取溫度（B）為40～65 ℃；提取時間（C）為0.5～3.0 h。每個影響因子設(shè)計3個重復(fù)性試驗，選用平均值作為試驗參數(shù)，確定各因素對試驗的影響[8]。

1.3.2蜚蠊多糖提取工藝的正交試驗。為了進一步優(yōu)化提取條件，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇了木瓜蛋白酶用量（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）這3個因素進行正交優(yōu)化試驗，采用L9（33）正交表安排試驗[9]，各因素水平見表 1。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1蛋白酶用量對蜚蠊多糖提取的影響。

由圖1可見，隨著木瓜蛋白酶用量的逐漸增加，提取得到的蜚蠊多糖含量也隨之增大，用量在200～300 μg/g時多糖含量增加的幅度較大，可能是由于隨著濃度梯度的幅度增大，細胞內(nèi)容物的擴散動力就越大，多糖溶出物就越多。而當酶用量為300 μg/g時，多糖的含量最大，達18.101%。

2.1.2提取時間對蜚蠊多糖提取的影響。由圖2可見，隨著提取時間的逐漸延長，蜚蠊多糖含量也逐漸增加，1.0～2.0 h間蜚蠊多糖含量增加的幅度不明顯，而1.5～2.0 h間多糖含量增加的幅度不明顯，在酶作用下，多糖隨著提取時間延長，所得多糖含量也增加，時間過長，酶活動減弱。在提取時間3.0 h時，多糖含量17.532%。

2.1.3溫度對蜚蠊多糖提取的影響。

溫度對多糖的提取具有顯著影響。由圖3可見，隨著提取溫度的升高，蜚蠊多糖含量也隨之增加，從45 ℃到50 ℃增加的幅度較明顯，可能由于隨著溫度的升高而酶活力逐漸加強。溫度顯著降低時，多糖含量變化不顯著，而當溫度升高到一定程度，可能會影響到木瓜蛋白酶的活性，多糖提取率呈逐漸下降趨勢。提取溫度為50 ℃時，多糖含量最高，為20.135%。

2.2正交試驗

由表 2試驗結(jié)果可知，不同因素對蜚蠊多糖含量影響的順序為：A>B>C，即酶用量對蜚蠊多糖含量影響最大，其次為提取溫度也影響著蜚蠊多糖的提取含量，提取時間影響較小。通過試驗，我們最后確定了蜚蠊多糖含量最佳的提取工藝條件為A3B3C1，即酶用量為300 μg/g，提取溫度60 ℃，提取時間1.0 h時提取的蜚蠊多糖含量最多。

3結(jié)論與討論

酶解法是近幾年來提取動物多糖的先進技術(shù)，這種方法的優(yōu)點是不會造成多糖的損失，可減少原材料的浪費。而試驗表明，不同材料提取次數(shù)過多，不僅浪費提取液和時間，還會產(chǎn)生大量濾液，濃縮較為困難。因此，選擇合理的提取次數(shù)不僅節(jié)省原藥材，降低成本投入，也不會明顯影響多糖的提取量。

影響蜚蠊多糖提取率的因素主要有：木瓜蛋白酶用量、提取溫度、提取時間等因素。通過正交試驗得出，提取溫度對蜚蠊多糖含量影響最大，其次為木瓜蛋白酶用量，提取時間和提取次數(shù)對多糖提取影響較小，蜚蠊多糖最佳提取工藝條件A3B3C1，即酶用量為300 μg/g，提取溫度60 ℃，提取時間1.0 h時提取的蜚蠊多糖含量最多。

通過酶解法來提取蜚蠊多糖工藝的優(yōu)化研究，可以獲得非常理想的優(yōu)質(zhì)蜚蠊多糖，為后期開展蜚蠊多糖的分離純化、多糖成分分析及對荷瘤小鼠抗腫瘤活性等試驗積累試驗數(shù)據(jù)，也為將來開發(fā)優(yōu)良的昆蟲多糖藥物及功能性食品服務(wù)。

參考文獻

[1]

肖小芹.美洲大蠊生物學(xué)特性及藥用價值研究[D].長沙：中南大學(xué)，2007.

[2] 蕭慶慈，肖泓，劉昆平.蜚蠊的古今應(yīng)用[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 2012， 35（1）： 55-59.

[3] 高永翔，扈曉宇，鐘森.蟑螂提取物對急性肝損傷動物模型的干預(yù)[J].藥物研究，2006，15（10）：3-4.

[4] 張丹.美洲大蠊抗腫瘤活性成分及其結(jié)腸定位片的研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2014：1-106.