張玲1 翁云層1 張云2 帥麗芳3 李婷婷1 王文敬1 李紅衛(wèi)1 趙衛(wèi)4 黎誠耀1★

·論著·

重組慢病毒載體介導不同啟動子驅(qū)動的綠色熒光蛋白在多種（不同）細胞中的表達影響

張玲1 翁云層1 張云2 帥麗芳3 李婷婷1 王文敬1 李紅衛(wèi)1 趙衛(wèi)4 黎誠耀1★

目的比較不同啟動子的慢病毒轉(zhuǎn)導細胞后，在不同細胞系中驅(qū)動綠色熒光蛋白表達的效率高低。方法采用3種不同啟動子的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染60 h后，收集慢病毒上清。用等量的三種慢病毒液轉(zhuǎn)導5種細胞系（293A、MOLT-4、PC3、DU145及RM1），72 h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)導效果；流式細胞儀計數(shù)轉(zhuǎn)導效率。結果不同啟動子（Ubiquitin，EF1α，CMV）在5種細胞系中驅(qū)動綠色熒光蛋白的表達及轉(zhuǎn)導效率不同。在293A和PC3細胞中，CMV為最強啟動子，轉(zhuǎn)導率分別為（94.83±2.87）％和（20.90±3.15）％；但在MOLT-4和DU145細胞中，EF1α為最強啟動子，轉(zhuǎn)導率分別為（74.27±2.14）％和（25.13±4.95）％；在RM1細胞中，Ubiquitin為最強啟動子，轉(zhuǎn)導率為（16.77±0.38）％。結論在慢病毒載體介導基因表達研究中，要考慮選取合理的細胞和啟動子以獲得高效的轉(zhuǎn)導效率。

重組慢病毒；綠色熒光蛋白

慢病毒（lentiviru，LV）由HIV-1改建而來，基因轉(zhuǎn)移效率高效而穩(wěn)定。不論是細胞處于有絲分裂活躍期還是處于分裂緩慢期及分裂終末期，LV均可以進行轉(zhuǎn)導；由LV攜帶整合入宿主基因組的目的基因可以在宿主細胞中進行長期而穩(wěn)定的表達；LV可兼容多個轉(zhuǎn)錄啟動子，可以同時進行多個基因的表達研究；可容納較長片段的外源基因（10 kb），大多數(shù)的cDNA都能被克隆入LV［1-10］。LV的上述優(yōu)點使其成為體內(nèi)和體外基因轉(zhuǎn)移的一種有效工具。本文意在構建不同啟動子的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，包裝重組慢病毒，觀察不同啟動子在不同細胞系中驅(qū)動綠色熒光蛋白表達效率高低。

1　材料與方法

1.1不同啟動子的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒（pTY-EF1α-eGFP和pTY-CMV-eGFP）及pFUGW

不同啟動子的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pTY-EF1α-eGFP和pTY-CMV-eGFP由本室前期構建完成，pFUGW及包裝質(zhì)粒pSPAX2和pMD2.G由南方醫(yī)科大學腫瘤研究所提供。

1.23種不同啟動子的慢病毒包裝及滴度測定

應用Qiagen公司無內(nèi)毒素的質(zhì)粒大量提取試劑盒提取pFUGW、pTY-EF1α-eGFP、pTY-CMV-eGFP、pSPAX2及pMD2.G用以轉(zhuǎn)染。紫外分光光度計測定質(zhì)粒的濃度與純度。測得的濃度分別為pMD2.G：0.85μg/μL，pPAX2：0.93μg/μL，pFUGW：0.65 μg/μL，pTY-EF1a-eGFP：1.09 μg/μL，pTYCMV-eGFP：1.21 μg/μL。-20℃保存。慢病毒的制備采用文獻報道方法［11］。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體法進行，轉(zhuǎn)染前一天消化傳代293T細胞，分別在3個T75細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待第二天細胞長滿至90％左右可以進行轉(zhuǎn)染。該包裝系統(tǒng)中pMD2.G：pPAX2：pTY-EF1a-CMV（pTY-CMV-eGFP、pFUGW）= 8∶15∶20（質(zhì)量比）。轉(zhuǎn)染前30 min～60 min，去除293T細胞培基，加入Opti-MEM?RI medium 1.7 mL；輕輕混勻（上下混）脂質(zhì)體2000，吸17 μL至0.5 mL Opti-MEM?RI medium（一個EP管）中，混勻，室溫放置5 min（Solution B）；將1.2 μg pMD2. G、4.0 μg pPAX2、6.7 μg pTY-EF1a-eGFP或3.3 μg pTY-CMV-eGFP或3.3 μg pFUGW加入0.5 mL Opti-MEM?RI medium中（另一個EP管）混勻（Solution A）；將A液加入B液中，混勻后室溫放置20 min；將AB混合液加入293T細胞中（加液體時細胞面朝上，以免沖落細胞）；6～8 h后用吸管吸去瓶中的AB混合液，加入完全培養(yǎng)基3 mL；12 h在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，60 h～72 h后收集病毒上清，4℃，3 000 rpm，離心15 min，吸取上清，再經(jīng)過0.45 μm一次性濾器過濾。收集病毒液，滴度測定采用本室已建立的慢病毒熒光定量PCR方法，包裝的慢病毒核酸能達到109copies/mL。

1.3病毒滴度測定

病毒滴度測定采用RT-QPCR法，針對LV 3′-LTR，參考［12］設計引物和探針，合成了用以定量LV核酸拷貝數(shù)的引物和探針，Probe（LTR-3）：AGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTG；Primer Forward（LTR-1）：TAAAGCTTGCCTTGAGTGCT；Primer Reverse（LTR-2）：GTCTGAGGGATCTCTA GTTACCAG。對3種包裝的LV，及其中LV-EF1a-EGFP病毒濃縮前后的病毒RNA，全部進行逆轉(zhuǎn)錄，將cDNA產(chǎn)物和質(zhì)粒標準品同時進行Real Time PCR反應定量。pTY-EF1a-eGFP質(zhì)粒標準品濃度1.09 μg/μL，換算成核酸拷貝數(shù)為1.06×1014copies/mL。10倍倍比稀釋為7個濃度，即standard 1∶1.06×1014，standard 2∶1.06×1013，standard 3∶1.06× 1012，standard 4∶1.06×1011，standard 5∶1.06×1010，standard 6∶1.06×109，standard 7∶1.06×108，同時設一個陰性對照。Real Time PCR反應體系如下：2.5 μL 10×PCR buffer（MgCl2），0.5 μL dNTP（10 mM），0.4 μL ROX DyeⅡ（50×），1 μL LTR1（10 μM）1 μL LTR2（10 μM）1 μL LTR3（5 μM），0.4 μL FastStart Taq（5 U/μL）14.2 μL ddH2O，4 μL LV cDNA，總反應體系為25 μL。在PCR儀上按下列條件進行反轉(zhuǎn)錄反應。在Stratagene Mx3005P熒光定量PCR儀上進行定量PCR反應，反應條件如下：95℃10 min預變性，95℃30 s變性，55℃退火與延伸1 min，進行45個循環(huán)反應；在55℃延伸的步驟對熒光信號進行采集。由標準曲線可得病毒滴度。

1.4不同啟動子的慢病毒轉(zhuǎn)導不同細胞系

293A、DU145、PC3、RM1細胞為貼壁細胞，待培養(yǎng)瓶中細胞生長到80％～90％時，消化傳代細胞，調(diào)整細胞濃度為5×105個/孔，后鋪6孔板，每孔3 mL，每種細胞鋪4個孔，3孔用以加病毒液，并設1個空白細胞對照。上述貼壁細胞鋪板培養(yǎng)12 h后，吸掉細胞培養(yǎng)基上清，校正病毒液至109copies/mL，然后將3種LV按每孔加入200 μL病毒液，37℃孵育1h后每孔加入2.8 mL 2％FBS DMEM維持液；MOLT-4為懸浮細胞，將適宜密度的MOLT-4細胞吹打分散均勻，調(diào)整細胞濃度為5×105個/mL后鋪6孔板，每孔3 mL細胞液，鋪3個細胞孔，并設1個空白細胞對照。將3種LV（LV-UBI-eGFP、LV-EF1α-eGFP、LV-CMV-eGFP）直接加入MOLT-4細胞孔，每孔加入200 μL LV。將6孔板置于37℃5％CO2的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。將實驗重復進行3次。72 h后在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況或通過FACS計數(shù)GFP表達陽性率。

1.5統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0 One-Way ANOVA進行方差分析。

2　結果

2.1熒光顯微鏡觀察eGFP表達情況

LV-CMV-eGFP、LV-EF1a-eGFP、LV-Ubi-eGFP 3種LV轉(zhuǎn)導293A、MOLT-4、PC3、DU145、RM1細胞系72 h后，熒光顯微鏡下觀察，不同啟動子驅(qū)動的GFP表達情況不同，如圖1所示。在293A細胞中，3種啟動子驅(qū)動蛋白表達作用均較強，但CMV驅(qū)動綠色熒光蛋白作用最強；在MOLT-4和DU145細胞中，EF1α驅(qū)動綠色熒光蛋白作用最強；在PC3細胞中，CMV驅(qū)動綠色熒光蛋白作用最強；在RM1細胞中，Ubiquitin驅(qū)動綠色熒光蛋白作用最強。

2.2流式細胞技術檢測LV轉(zhuǎn)導不同細胞系的轉(zhuǎn)導效率高低

采用流式細胞技術對不同啟動子的LV轉(zhuǎn)導不同細胞系的轉(zhuǎn)導效率進行了分析。3種不同啟動子（Ubiquitin，EF1α，CMV）的LV在5種細胞系（293A、MOLT-4、PC3、DU145及RM1）中的轉(zhuǎn)導效率不同（見表1）。在293A和PC3細胞中，啟動子為CMV的LV轉(zhuǎn)導率最高分別為（94.83± 2.87）％和（20.90±3.15）％；但在MOLT-4和DU145細胞中，啟動子為EF1α的LV轉(zhuǎn)導率最高，分別為（74.27±2.14）％和（25.13±4.95）％；在RM1細胞中，啟動子為Ubiquitin的LV轉(zhuǎn)導率最高，為（16.77±0.38）％。

2.3統(tǒng)計學分析

對于UBI、EF1α和CMV不同啟動子介導的不同細胞系轉(zhuǎn)導率分析，P值均為0.000，3種啟動子在5種細胞組內(nèi)的轉(zhuǎn)導率差異顯著，兩兩比較，UBI、EF1α和CMV啟動子均在293A細胞上為轉(zhuǎn)導率最高。對于UBI、EF1α和CMV不同啟動子介導的同一細胞系轉(zhuǎn)導率分析，對于DU145細胞系，P＞0.05，顯示3種啟動子的轉(zhuǎn)導率無顯著差異。對于293A、PC3、RM1細胞系，P＜0.05，顯示3種啟動子在同種細胞中轉(zhuǎn)導率差異顯著。兩兩比較，293A和PC3中CMV啟動子最強，RM1中UBI最強。

3　討論

本研究比較了含有3種不同啟動子（EF1α、CMV、UBI）的LV，分別轉(zhuǎn)導不同的細胞系293A、MOLT-4、DU145、PC3及RM1。實驗觀察到不同啟動子介導的不同細胞轉(zhuǎn)導率差異顯著。

據(jù)報道，CMV是目前最強的啟動子［12］。但我們的研究表明，并不是在所有的細胞系中CMV驅(qū)動活性都最強。結果如圖1所示，在293A細胞中，3種啟動子驅(qū)動蛋白表達作用均較強，但CMV驅(qū)動綠色熒光蛋白作用最強；在MOLT-4和DU145細胞中，EF1α驅(qū)動綠色熒光蛋白作用最強；在PC3細胞中，CMV驅(qū)動綠色熒光蛋白作用最強；在RM1細胞中，Ubiquitin驅(qū)動綠色熒光蛋白作用最強。這與流式細胞技術檢測的不同啟動子的LV在5種細胞系上的轉(zhuǎn)導效率結果相一致（表1）。文獻［13-14］探討了CMV、EF1α和PGK啟動子在293T、HOS及Hela細胞中的活性，結果表明，在293T細胞中，CMV驅(qū)動GFP表達能力是EF1α和PGK的4.2～6.3倍，在HOS細胞中，CMV和EF1α有相同的驅(qū)動活性。但在Hela細胞中，EF1α驅(qū)動活性最強。這與我們在293細胞系中監(jiān)測的結果一致，CMV啟動子驅(qū)動活性最強，且不同啟動子在不同細胞系中的驅(qū)動活性是不一致的，提示基因表達研究時選取適宜的啟動子以驅(qū)動目的基因的表達。

圖1　不同啟動子驅(qū)動的GFP在不同細胞系中的表達Figure 1GFP expression among various cells lines

表1　流式細胞術檢測LV轉(zhuǎn)導72 h后各細胞系陽性細胞百分率（±s）Table 1 The percentage of positive counts among different cell cultures transduced with lentivirus for 72 h by flow cytometry（x±s）

表1　流式細胞術檢測LV轉(zhuǎn)導72 h后各細胞系陽性細胞百分率（±s）Table 1 The percentage of positive counts among different cell cultures transduced with lentivirus for 72 h by flow cytometry（x±s）

陽性細胞百分比（％）細胞系n 293A MOLT-4 PC3 DU145 RM1 3 3 3 3 3 LV-UBI-EGFP 89.13±4.28 64.83±13.01 5.57±0.31 24.10±5.53 16.77±0.38 LV-EF1α-EGFP 79.90±6.25 74.27±2.14 14.07±1.20 25.13±4.95 10.23±1.12 LV-CMV-EGFP 94.83±2.87 5.87±1.70 20.90±3.15 16.87±3.92 9.53±0.65

Li［15］等研究了不同啟動子的LV轉(zhuǎn)導神經(jīng)系統(tǒng)細胞活性的研究。在不同的神經(jīng)元和細胞培養(yǎng)物中，蛋白表達水平差異顯著。他們系統(tǒng)地評價了不同啟動子驅(qū)動的外源基因在小鼠大腦皮層神經(jīng)元、小腦顆粒細胞及分化和未分化的神經(jīng)母細胞瘤中表達活性的強弱。在原代皮層神經(jīng)元中，Ubiquitin C啟動子驅(qū)動外源基因表達作用最強。PGK啟動子驅(qū)動基因表達活性也較強，但是CMV和MND啟動子驅(qū)動活性較弱，只有少量神經(jīng)元細胞表達外源基因。但在小腦顆粒細胞及分化的SHSY5Y細胞中，CMV驅(qū)動活性最強。這為LV應用于神經(jīng)系統(tǒng)提供了指導作用。MOLT-4為人急性淋巴細胞性白血病細胞系，PC3、DU145為人前列腺癌細胞、RM1為小鼠前列腺癌細胞，啟動子在上述細胞系中的驅(qū)動活性研究，為選用適宜啟動子的LV以使目的基因在上述靶細胞中高效表達奠定基礎。

本研究表明不同啟動子在不同細胞內(nèi)驅(qū)動EGFP表達能力不同。針對特定靶細胞和組織，選擇最適宜的啟動子構建重組LV，有效驅(qū)動外源基因的高效表達，進而對實現(xiàn)LV轉(zhuǎn)導的基因治療具有重要指導意義。

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Green florescence protein expression in various cells driven by different promoters among lentivirus

ZHANG Ling1，WENG Yunceng1，ZHANG Yun2，SHUAI Lifang3，LI Tingting1，WANG Wenjing1，LI Hongwei1，ZHAO Wei4，LI Chengyao1★
（1.Department of Transfusion Medicine，School of Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515；2.Department of Orthopaedics，Linqu Traditional Chinese Medicine Hospital，Weifang，Shandong，China，262600；3.Guangzhou Millitary Center for Disease Control and Prevention，Guangzhou，Guangdong，China，510515；4.School of Public Health and Tropical Medicine，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

ObjectiveTo compare the GFP expression efficiency of transduced cells driven by lentivirus with different promoters.Methods293T cells were co-transfected with packaging plasmids and three kinds of transfer plasmids.Then the supernatant was collected after 60 hours.5 cell lines（293A，MOLT-4，PC3，DU145 and RM1）were transduced by equal load of these lentivirus.72 hours later，GFP expression was observed with florescence microscope and transduction efficency was counted by FASC.ResultsGFP expression and transduction efficiency among 5 cell lines were different.Among 293A and PC3 cells，CMV promoter was the strongest one and transduction efficiency can achieve（94.83±2.87）％and（20.90±3.15）％，respectively.But among MOLT-4 and DU145 cells，EF1α promoter was the strongest one and transduction efficiency can achieve（74.27±2.14）％and（25.13±4.95）％，respectively.In RM1 cells，Ubiquitin promoter was the strongest one and it can achieve（16.77±0.38）％.ConclusionIn the study of gene expression mediated by lentivirus，proper cell lines and promoters should be selected to obtain high efficiency.

Recombinant lentivirus；Green florescent protein

國家自然科學基金（81301433）

1.南方醫(yī)科大學生物技術學院輸血醫(yī)學系，廣東，廣州510515 2.臨朐縣中醫(yī)院骨外科，山東，濰坊261000 3.廣州軍區(qū)疾病預防控制中心，廣東，廣州510515 4.南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學學院，廣東，廣州510515

黎誠耀，E-mail：chengyaoli@hotmail.com