鄧開鳳 戴盛明★

·綜述·

實時熒光定量PCR檢測血清/血漿microRNAs臨床應(yīng)用前的準(zhǔn)備

鄧開鳳 戴盛明★

現(xiàn)已證明血清/血漿microRNAs（miRNAs）表達譜的變化與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。血清/血漿miRNAs分子穩(wěn)定，不易降解，且標(biāo)本采集創(chuàng)傷小、便捷，非常適合應(yīng)用于臨床實驗室檢測。因此miRNAs極有可能成為未來疾病診斷和預(yù)后評估的分子標(biāo)志物乃至治療靶標(biāo)。實時熒光定量PCR檢測法（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）操作簡便，需要的RNA量較少，靈敏度極高，能在短時間內(nèi)獲得結(jié)果，并可同時檢測多種miRNAs表達，有良好的應(yīng)用前景。本文將詳細(xì)探討現(xiàn)階段用于血清/血漿miRNAs定量檢測的RT-qPCR方法，以及總結(jié)血清/血漿miRNAs定量檢測應(yīng)用于臨床檢驗應(yīng)注意的問題。

MicroRNAs；血清/血漿；實時熒光定量PCR

miRNAs發(fā)現(xiàn)始于1993年，Lee等研究人員在秀麗新小桿線蟲（caenorhabditis elegans，C. elegans）中意外發(fā)現(xiàn)控制著線蟲時序性發(fā)育的雙鏈小RNA分子lin-4［1］。直至2000年，Reinhart［2］等發(fā)現(xiàn)第二個具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能的RNA小分子let-7，miRNAs才逐漸進入人們的視野成為一個嶄新的研究領(lǐng)域。越來越多的研究人員相繼發(fā)現(xiàn)了這類具有調(diào)控調(diào)控作用的小RNA分子。目前人們普遍的共識是：miRNAs是一類高度保守，長度在19～24個核苷酸（nucleotide，nt）左右的內(nèi)源性非編碼小分子RNA。而外周血循環(huán)miRNAs是組織細(xì)胞分泌產(chǎn)生［3］，成熟的miRNAs在細(xì)胞內(nèi)被脂質(zhì)或脂蛋白包被成外切酶體（exosome），分泌至胞外并進入血液，外切酶體通過內(nèi)吞作用進入受體細(xì)胞，釋放出miRNAs發(fā)揮生物學(xué)功能［4］。生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，哺乳動物miRNAs能調(diào)控超過60％的基因，在細(xì)胞發(fā)育、凋亡、分化、增殖等重要的生理病理過程中均發(fā)揮重要作用［5］。疾病時期，血清/血漿中相關(guān)miRNAs表達譜以及含量的改變提示人們miRNAs或可成為一種新的有助于疾病預(yù)測、診斷和預(yù)后的標(biāo)志物［6］。血清/血漿miRNAs的穩(wěn)定使其定量檢測成為可能。由于miRNAs分子量小，表達水平極低，因而需要極為靈敏的定量分析方法，實時熒光定量PCR檢測法（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）被認(rèn)為是miRNAs定量的金標(biāo)準(zhǔn)［7］，本文將詳細(xì)探討現(xiàn)階段用于血清/血漿miRNAs定量檢測的RT-qPCR技術(shù)及存在的問題。

1　血清/血漿miRNAs實時熒光定量PCR檢測

RT-qPCR是指在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量。其能在短時間內(nèi)獲得結(jié)果，可同時檢測多個miRNAs表達，需要的miRNAs量較少（1～10 ng總RNA），因而特別適合于miRNAs含量極低的血清/血漿檢測［8］。miRNAs是極有吸引力的候選生物標(biāo)志物，而RT-qPCR檢測血清/血漿miRNAs如要應(yīng)用于臨床，在實驗的每個階段都必須有統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，才能獲得準(zhǔn)確、可重復(fù)的結(jié)果，包括分析前的質(zhì)量控制，如標(biāo)本的選擇，采集與運送保存；分析中miRNAs提取操作流程，cDNA的合成策略，RT-qPCR中引物設(shè)計，校參選擇，擴增產(chǎn)物檢測，以及后續(xù)的數(shù)據(jù)分析，都應(yīng)具備最可靠的溯源。

1.1分析前

標(biāo)本的選擇，采集與運送保存：盡管miRNAs［9-11］在其他體液如乳汁、尿液甚至是唾液中也存在（含量更微），但血液檢測最方便、可信，因此血液檢測仍然是目前臨床上最常用的檢測標(biāo)本。已有實驗證明［12］，血漿與血清miRNAs含量無明顯差異，且具有很強的相關(guān)性，均適合作為疾病的標(biāo)志物檢測樣本。實驗室定量實驗前應(yīng)根據(jù)前期目的miRNAs篩選樣本，或者通過比較實驗選取最佳的樣本類型，如是血漿還需注意抗凝劑對PCR擴增效率的影響［13］。標(biāo)本細(xì)胞殘留、溶血、脂血、黃疸對檢查都有影響：某些目的miRNAs在血細(xì)胞中亦有表達［14-15］，則須在血清/血漿收集時優(yōu)化離心力的大小、離心次數(shù)，以盡可能的消除殘余細(xì)胞污染；溶血可干擾PCR反應(yīng)過程［16］，則應(yīng)避免造成血球破裂的動作，如用太細(xì)的針頭抽血、或病人本身因疾病或治療造成的敗血或溶血現(xiàn)象等可能影響結(jié)果的因素都必須列入評估；脂血、黃疸等異常標(biāo)本也應(yīng)通過實驗驗證對檢測結(jié)果產(chǎn)生何種影響。

miRNAs在血清/血漿中存在較穩(wěn)定［17］，耐RNA酶降解，煮沸、反復(fù)凍融、酸堿環(huán)境等各種處理方法均不會造成miRNAs損失［4，18］，但隨著保存時間的延長，依然能觀察到血清/血漿miRNAs會發(fā)生不同程度的降解［19］。因此需要制定統(tǒng)一規(guī)范的標(biāo)本采集、運送與分裝保存流程，以期盡可能減少miRNAs的降解，保證檢測結(jié)果的重復(fù)性與準(zhǔn)確性，以及不同病程時期結(jié)果的可比性。

1.2分析中

1.2.1miRNAs提取

目的miRNAs提取量的多少直接決定后續(xù)檢測結(jié)果。血清/血漿miRNAs分子量小，且含量極低，如何從樣本中分離出全面、且濃度高的RNA組分是miRNAs檢測的前提。目前實驗室常用的RNA提取純化方法，如有機溶劑抽提加乙醇沉淀法，能較好地保留小分子RNA，然而后續(xù)的脫鹽和沉淀步驟容易導(dǎo)致miRNAs流失、鹽類和有機溶劑殘留，影響定量實驗操作反應(yīng)［20］；而硅膠膜離心柱法只能富集較大分子的RNA（＞200 nt），小分子RNA往往被漏掉，因而不適用于小分子RNA的分離純化。這兩種方法都存在標(biāo)本需要多、人為誤差大、提取效率有差異、獲得的miRNAs種類及數(shù)量差異大等缺點［21］，因此無法保證miRNAs檢測結(jié)果的重復(fù)性與準(zhǔn)確性。商品化的試劑盒因其優(yōu)化的實驗設(shè)計和統(tǒng)一的操作流程，能有效快速地純化miRNAs，實現(xiàn)樣本處理的標(biāo)準(zhǔn)化，因此選擇最優(yōu)的miRNAs提取試劑盒是保證結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確的另一前提。

1.2.2cDNA合成

成熟的miRNAs只有19～24 nt，無Poly A尾，使得miRNAs的逆轉(zhuǎn)錄較mRNA更為復(fù)雜。目前，miRNAs逆轉(zhuǎn)錄的方法主要有特異性莖環(huán)引物法和miRNAs加尾法。莖環(huán)引物法［22］（見圖1）針對目的miRNAs設(shè)計一段特殊的莖環(huán)狀引物，該引物中除含有一段與被檢miRNAs互補的特異序列外，還含有一段較長的本身有部分堿基互補配對并形成環(huán)狀的共有序列。莖環(huán)狀引物與被檢miRNAs退火反轉(zhuǎn)錄后，能得到一段較長的cDNA，然后以此為模板，針對特異的miRNAs設(shè)計引物進行PCR擴增，一條miRNAs序列特異對應(yīng)一個莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RT引物；miRNAs加尾法則先利用Poly（A）聚合酶對總RNA進行加尾處理，使所有miRNAs的3′端加上一段Poly（A）尾，然后用帶有特殊Poly（T）接頭序列的引物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，以此為模板，針對目的miRNAs設(shè)計引物進行PCR擴增。

與莖環(huán)狀引物法相比，RNA加尾法的最大優(yōu)點是能一次性對所有的miRNAs進行加尾反應(yīng)，將所有的miRNAs反轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)cDNA，操作及引物設(shè)計簡單，但是RNA在反轉(zhuǎn)錄前需要進行末端Poly（A）加尾，特異性稍低。因此，莖環(huán)法可特異針對成熟的目標(biāo)miRNAs，是目前最常用的定量檢測已知miRNAs方法。綜合比較，設(shè)計特異的莖環(huán)狀引物針對目的miRNAs是血清/血漿定量檢測的較好選擇，其優(yōu)點在于可以不用對miRNAs進行加尾，防止引物與miRNAs前體及其他RNA結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄引物5′端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)形成的堿基堆積和空間限制能顯著增強逆轉(zhuǎn)錄的特異性，同時莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開后可以增加miRNAs的長度，為PCR擴增提供合適的模板。primer5.0、DNAstar、dnaman以及miRprimer都可以設(shè)計miRNAs特異性莖環(huán)引物，選擇其中最合適的引物進行后續(xù)的試驗。

1.2.3qPCR引物設(shè)計

研究人員發(fā)現(xiàn)越來越多的miRNAs，其同一家族的miRNAs序列往往相似，有時只有一個堿基差異［8］。特異性莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物合成后，cDNA的qPCR特異性引物設(shè)計又是一大挑戰(zhàn)。通常，上游引物是根據(jù)miRNAs自身序列設(shè)計，如GC含量太低，可以在上游引物5′端加入GCGCC等的保護堿基；下游引物則在RT引物的反向互補序列中找。也即上游引物是每個miRNAs所特有的，下游引物為通用引物。通常情況下，上游引物序列與待測miRNAs序列基本一致，并將原有的U替換成T，通過增加或減少堿基來調(diào)整Tm值與下游引物接近即可。

圖1　頸環(huán)法real-time PCR原理圖［22］Figure 1Schematic description of stem-loop RT real-time PCR［22］

1.2.4校參選擇

qPCR結(jié)果需要進行標(biāo)準(zhǔn)化以消除非生物學(xué)變化對結(jié)果的影響，使用外源性小RNA或內(nèi)源性基因是兩種標(biāo)準(zhǔn)化的常用介質(zhì)。早先研究人員使用外源性小RNA校正qPCR定量結(jié)果，如線蟲的miR-39［23］、miR-238［24］等。但后來的研究發(fā)現(xiàn)，如果把純化出的miRNAs加入到血清/血漿中時，會發(fā)生降解的現(xiàn)象［25］。因此，外源性小RNA不能很好的監(jiān)測miRNAs的提取效率，更無法校正cDNA合成效率以及qPCR定量結(jié)果，而不具有參照作用。這一結(jié)果也提示研究人員在目的miRNAs提取后應(yīng)采取措施避免靶核酸的降解，盡快進行后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄以及定量PCR反應(yīng)。

內(nèi)源性基因是目前使用最廣泛的校參策略。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該在所要研究的疾病體系或樣品類型中都表達恒定。早前的內(nèi)源性基因如miR-16，在后來的研究中發(fā)現(xiàn)，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也扮演著重要的角色［3］，并且在癌癥患者與正常對照之間表達有顯著差異，溶血也會影響miR-16含量檢測［26］，說明其無法作為某一疾病的內(nèi)參；而U6 snRNA（簡稱U6），在血清血漿中表達水平較低，并且在肝癌患者中表達下調(diào)，說明也無法勝任肝臟疾病的內(nèi)參［27］。可見必須根據(jù)病種篩選適合試驗體系的特異性穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因［28］。采用多個內(nèi)源性基因以組合的方式作為內(nèi)參的研究，Chen［29］利用Illumina篩選檢測以及RT-qPCR驗證，發(fā)現(xiàn)血清中Let-7d、Let-7g和Let-7i的miRNAs組合模式優(yōu)于前人用過的U6、RNU44、RNU48等，并可作為多種疾病定量的內(nèi)參選擇。專用于篩選穩(wěn)定性內(nèi)參基因的軟件，如GeNorm、BestKeeper和NormFinder，在研究某一疾病miRNAs表達譜變化時，即可利用以上軟件確定在疾病患者樣本中穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因［30-31］。Han利用NormFinder和BestKeeper程序軟件發(fā)現(xiàn)U6與miR-192既可以單獨也可以組合的模式用于胸腔積液合并肺膿腫與肺腺癌惡性腫瘤病人血清RT-qPCR的內(nèi)參選擇［32］。Fritz［33］則提出利用樣本自身miRNAs（21/ 10b）定量比值作為腎透明細(xì)胞癌的一個血清標(biāo)志物，直接簡便，前提是通過大樣本的標(biāo)準(zhǔn)化篩選實驗證明該比值的敏感性與特異性達到臨床診斷的要求。Albonico發(fā)現(xiàn)miR-17-5p/miR-155比值可作為犬脾淋巴癌的分子診斷工具［34］。

1.2.5RT-qPCR產(chǎn)物檢測與數(shù)據(jù)分析

qPCR產(chǎn)物檢測主要有SYBR-Green I和TaqMan探針2種方法，目前主流使用的是TaqMan探針。TaqMan探針與特異性產(chǎn)物結(jié)合的短序列，其5′端標(biāo)記熒光報告基團，3′端含有淬滅基團，探針完好時淬滅基團吸收報告基團的熒光。當(dāng)PCR反應(yīng)進行時，Taq酶水解探針，熒光報告基團發(fā)出熒光信號，每合成一個雙鏈就產(chǎn)生一個熒光信號被儀器捕捉。TaqMan探針不受miRNAs前體、引物二聚體和非特異性擴增產(chǎn)物的干擾，對于家族miRNAs的檢測特異性高。

RT-qPCR數(shù)據(jù)分析存在許多種算法。其中最簡單原始的方法是ΔCt法，此法僅分析Ct值，公式為：ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），不考慮擴增效率的影響，即認(rèn)為目的miRNAs與內(nèi)參基因的擴增效率都為100％，所以無法準(zhǔn)確估計目的miRNAs的初始含量。2-ΔΔCT法則在ΔCt法的基礎(chǔ)上，將每一組樣本每一個目的基因的ΔCt減去對照組樣本的ΔCt，并同時對所有結(jié)果取相反數(shù)（即加一個負(fù)運算，正數(shù)變?yōu)樨?fù)數(shù)，負(fù)數(shù)變?yōu)檎龜?shù)），該步運算得到的結(jié)果即為-ΔΔCt。最后，對-ΔΔCt進行2的冪運算，即2-ΔΔCT得出倍數(shù)變化值（fold change）。fold change值具有放大效應(yīng)，可體現(xiàn)兩組樣本的差異趨勢，但容易出現(xiàn)目的miRNAs含量被高估的情況。美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（applied biosystems，ABI）提供的一個分析方法是計算log2R，即log2為底對R求對數(shù)，R就是2-ΔΔCT。綜合以上分析，事實上，計算出-ΔΔCt這一步即可，得到的正值表示較對照組miRNAs上調(diào)，負(fù)值表示較對照組miRNAs下調(diào)，數(shù)據(jù)圖非常直觀，也沒有放大效應(yīng)，顯著性分析較為準(zhǔn)確。這種運算方法關(guān)鍵在于ΔΔCt取相反數(shù)，以及實驗組和對照組劃分清晰，才能得到正確的結(jié)果。當(dāng)然，也可根據(jù)目的miRNAs（含量低）定量的目標(biāo)，在實驗設(shè)計嚴(yán)謹(jǐn)，將誤差控制在最小范圍的情況下，選擇相應(yīng)的計算方法，如可放大效應(yīng)的2-ΔΔCT法。數(shù)據(jù)分析應(yīng)該高度客觀，不合理的分析會得到錯誤結(jié)果，因此需要通過對RT-qPCR的每一組分進行質(zhì)量評價以達到最小化變異性和最大化可重復(fù)性，而且還需要沿用一個通用的數(shù)據(jù)分析方法以達到臨床診斷需要的基因表達分析標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3分析后

臨床標(biāo)本血清/血漿miRNAs在RT-qPCR檢測后，通常涉及檢驗樣本的保存，以備復(fù)查。未提取miRNAs的原始血清/血漿可根據(jù)臨床的需要，如監(jiān)測疾病的始末以及后續(xù)對疾病的研究等，通過分裝保存于-80℃或液氮的方式長期保存。而提取得到的miRNAs，因其失去基團的保護而變得容易降解，保存條件極為苛刻，因此需要及時選擇合適的方式保存。目前的方式有將miRNAs置于-70℃的無水乙醇里長期保存，使用時離心沉淀；或者是現(xiàn)今普遍為大家接受的，將miRNAs逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，再-20℃分裝保存，其中要注意miRNAs水解酶的去除，如加入DEPC；另外，還有一個高成本的保存模式，即利用RNA穩(wěn)定劑（RNA stable）［35-36］與提取得到的miRNAs混合，經(jīng)過干燥后，可長期保存達12年之久。以上各保存方法用于臨床時，仍然需要通過實驗驗證，以保證血清/血漿miRNAs在不同時間檢測結(jié)果的重復(fù)性。

2　總結(jié)

miRNAs與疾病相關(guān)［37］，現(xiàn)已利用RT-qPCR技術(shù)檢測出非常多與疾病的診斷與治療相關(guān)的miRNAs標(biāo)志物。如miRNA-143在結(jié)直腸癌血漿樣本中低表達，研究推測其可能與提高結(jié)直腸癌患者對奧沙利鉑的敏感性以及阻止TLR2通路有關(guān)［38-39］。但是要將miRNAs RT-qPCR用于臨床存在很多需要解決的問題。其一，血清/血漿中miRNAs含量極少，1 mL血的抽提總量可能只在ng或pg等級，這意味著在實施定量檢測時，血清/血漿miRNAs須從標(biāo)本采集開始標(biāo)準(zhǔn)化，擬定最佳的miRNAs提取方案以及最優(yōu)的實驗設(shè)計，包括最大化避免miRNAs降解，設(shè)計特異性莖環(huán)引物，以及擴增效率不被抑制的qPCR等；其二，需進行大規(guī)模的健康人群篩查，包括不同性別和年齡的血清/血漿表達譜信息，完善相關(guān)標(biāo)志物的腫瘤特異性，以及腫瘤患者個體間的異質(zhì)性，甚至是miRNAs表達的時空特異性；最后，標(biāo)準(zhǔn)化血清/血漿miRNAs RT-qPCR檢測的每一個細(xì)節(jié)，使其成為疾病診斷與預(yù)后判斷的有力工具。

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The preparation of real-time fluorescent quantitative PCR detection of serum/plasma microRNAs before clinical application

DENG Kaifeng，DAI Shengming★
（Liuzhou Key Laboratory of Tumor Diseases and Prevention，Clinical Laboratory，F(xiàn)ourth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Liuzhou，Guangxi，China，545005）

It has been proved that the changes of serum/plasma microRNAs（miRNAs）expression relates to the occurrence and development of various diseases.The molecular of serum/plasma miRNAs are stable and hard to degrade.It is easy to obtain blood specimen from small wound and suitable to detect for clinical laboratory.Therefore，miRNAs are most likely to become a potential biomarker for disease diagnosis and prognosis evaluation，even the target spot of treatment.As is easy to operate with few RNA，and with high sensitivity to detect a variety of miRNAs expression in a short time，real time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR）detection method has a good application prospect.In this paper，a review on the detection methods of serum/plasma miRNAs with RT-qPCR at the present stage will be discussed，and the countermeasures on the clinical application of serum/plasma miRNAs quantitative detection will be summarized.

MicroRNAs；Serum/plasma；Real-time quantitative PCR

國家自然科學(xué)基金（81160269）

廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，柳州市腫瘤疾病與防治重點實驗室，廣西，柳州545005

戴盛明，E-mail：daishm@sina.com