蔡　娟，劉世堯，韋正鑫，張　丹，潘雪珍，卞京軍，白志川（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715）

皺皮木瓜皮渣齊墩果酸和熊果酸提取工藝優(yōu)化研究

蔡娟，劉世堯，韋正鑫，張丹，潘雪珍，卞京軍，白志川*
（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715）

優(yōu)化利用皺皮木瓜鮮果皮渣進(jìn)行齊墩果酸和熊果酸最佳提取工藝條件。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化皺皮木瓜鮮果皮渣齊墩果酸和熊果酸提取的最佳工藝條件，利用高效液相色譜法進(jìn)行目標(biāo)性成分指標(biāo)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，皺皮木瓜鮮果皮渣齊墩果酸和熊果酸的最佳工藝為95%乙醇，料液比1∶15g/mL，提取時(shí)間50min，提取溫度70℃，此條件下齊墩果酸和熊果酸的總提取率為1.607%。本實(shí)驗(yàn)所得工藝方法穩(wěn)定可靠、操作簡(jiǎn)單，可以為皺皮木瓜皮渣進(jìn)行齊墩果酸和熊果酸工業(yè)化生產(chǎn)提供參考數(shù)據(jù)。

高效液相色譜，齊墩果酸，熊果酸，皺皮木瓜

皺皮木瓜為薔薇科木瓜屬植物貼梗海棠的果實(shí)，味酸、性溫，入肝、脾經(jīng)，有平肝和胃、去濕舒筋的功效［1］。臨床用以治療吐瀉轉(zhuǎn)筋、濕痹、腳氣、水腫、痢疾等癥。皺皮木瓜化學(xué)成分的研究表明［2-3］，富含超氧化物歧化酶、五環(huán)三萜有機(jī)酸類的齊墩果酸和熊果酸、抗壞血酸、黃酮類物質(zhì)、鞣質(zhì)、皂甙等成分。近年來隨著重慶皺皮木瓜鮮果加工業(yè)的發(fā)展，生產(chǎn)超氧化物歧化酶后的鮮果皮渣排放量也在逐年增加，造成了原料的大量浪費(fèi)。而目前我國(guó)對(duì)皺皮木瓜皮渣的開發(fā)缺少有效的手段，不僅影響了果業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，也造成了環(huán)境的污染［4］。

齊墩果酸（oleanic acid，OA）和熊果酸（ursolic acid，UA）是皺皮木瓜的主要活性成分［5］。齊墩果酸是五環(huán)三萜類有機(jī)酸化合物，分子式為C30H48O3，具有消炎抑菌、降低轉(zhuǎn)氨酶的作用，還有促進(jìn)肝細(xì)胞再生、防止肝硬化、強(qiáng)心、利尿、降血脂、降血糖、增強(qiáng)有機(jī)體免疫功能、抑制變態(tài)反應(yīng)等作用，是當(dāng)前治療肝炎的有效藥物之一，近年又證明有抗癌活性。熊果酸是齊墩果酸的同分異構(gòu)體，藥理研究證明其具有顯著的抗癌、促進(jìn)免疫、降血脂和降血糖功效［6-7］。二者結(jié)構(gòu)復(fù)雜，尚無化學(xué)合成品，主要靠從天然植物中提取獲取，近年來有關(guān)齊墩果酸和熊果酸的提取已成為天然產(chǎn)物加工領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究之一［8-9］。

王志芳等［10］用高效液相色譜法測(cè)定了回流法對(duì)齊墩果酸和熊果酸提取工藝研究，而本實(shí)驗(yàn)以皺皮木瓜鮮果皮渣為原料，采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)方法結(jié)合對(duì)皺皮木瓜齊墩果酸和熊果酸的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在確定其最佳的提取工藝，為重慶皺皮木瓜鮮果皮渣的有效開發(fā)利用提供理論支撐。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

皺皮木瓜皮渣于2013年9月中旬取自重慶盛木生物科技有限公司加工車間，經(jīng)重慶市西南大學(xué)園藝園林學(xué)院白志川教授鑒定為薔薇科木瓜屬植物皺皮木瓜（Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai）成熟果實(shí)超氧化物歧化酶提取皮渣；齊墩果酸（110709-200505）、熊果酸（110742-200516）標(biāo)準(zhǔn)品純度99%以上，HPLC級(jí)，購(gòu)于中國(guó)食品藥用檢定研究院；95%乙醇、甲醇、磷酸均為化學(xué)純。

DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；FE-10高速藥材粉碎機(jī)浙江溫嶺市百樂粉碎設(shè)備廠；KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)昆山超聲儀器有限公司；TDL-5A型臺(tái)式離心機(jī)上海哈菲爾分析儀器有限公司；Molgene210a型超純水機(jī)上海摩爾科學(xué)儀器有限公司；Mettler Toledo萬(wàn)分之一電子天平瑞士梅特勒-托利多公司；Waters e2695高效液相色譜儀沃特世科技（上海）有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1供試品溶液制備方法皺皮木瓜SOD提取殘?jiān)?5℃恒溫鼓風(fēng)干燥至恒重→粉碎15min→過80目篩→齊墩果酸和熊果酸提取→HPLC檢測(cè)

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備方法精密稱取11.8mg齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品和12.6mg熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品，10mL容量瓶甲醇定容，每1mL中含有齊墩果酸1.18mg和熊果酸1.26mg。精密吸取該液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，分別置于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。按上述色譜柱進(jìn)樣，根據(jù)成峰保留時(shí)間定性，根據(jù)峰面積值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3HPLC色譜檢測(cè)方法色譜條件：Waters e2695型高效液相色譜儀，Waters 2998型二極管陣列檢測(cè)器，Empower 2色譜工作站。色譜柱：Waters SunFire C18柱（4.6mm×150mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸（90∶10，V/V）［11］；流速1mL·min-1；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；流量0.8mL·min-1；進(jìn)樣量10μL。

1.2.4OA和UA提取工藝優(yōu)化方法

1.2.4.1單因素提取工藝優(yōu)化

a.提取方法的優(yōu)化精密稱取木瓜殘?jiān)?.000g，分別用浸提法、滲漉提取法、回流提取法、超聲波輔助提取等方法，95%乙醇，料液比1∶20，提取溫度30℃，提取40min，提取兩次，合并濾液，0.22μm微孔尼龍66型有機(jī)微孔濾膜過濾，按照1.2.3進(jìn)行HPLC檢測(cè)，三次重復(fù)，根據(jù)回歸方程計(jì)算齊墩果酸和熊果酸總提取率。

b.提取溶劑濃度的優(yōu)化精密稱取木瓜殘?jiān)?.000g，分別用80%乙醇、85%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、99%甲醇，料液比1∶20，30℃，超聲波輔助提取40min，提取兩次，合并濾液，0.22μm微孔尼龍66型有機(jī)微孔濾膜過濾，按照1.2.3進(jìn)行HPLC檢測(cè)，三次重復(fù)，根據(jù)回歸方程計(jì)算齊墩果酸和熊果酸總提取率。

c.料液比的優(yōu)化精密稱取木瓜殘?jiān)?.000g，用95%乙醇，分別按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，30℃，超聲波輔助提取40min，提取兩次，合并濾液，0.22μm微孔尼龍66型有機(jī)微孔濾膜過濾，按照1.2.3進(jìn)行HPLC檢測(cè)，三次重復(fù)，根據(jù)回歸方程計(jì)算齊墩果酸和熊果酸總提取率。

d.提取時(shí)間的優(yōu)化精密稱取木瓜殘?jiān)?.000g，用95%乙醇，料液比1∶20，30℃條件下分別提取20、30、40、50、60、70、80min，提取兩次，合并濾液，0.22μm微孔尼龍66型有機(jī)微孔濾膜過濾，按照1.2.3進(jìn)行HPLC檢測(cè)，三次重復(fù)，根據(jù)回歸方程計(jì)算齊墩果酸和熊果酸總提取率。

e.提取溫度的優(yōu)化精密稱取木瓜殘?jiān)?.000g，用95%乙醇，料液比1∶20，分別按30、40、50、60、70、80℃，超聲波輔助提取40min，提取兩次，合并濾液，0.22μm微孔尼龍66型有機(jī)微孔濾膜過濾，按照1.2.3進(jìn)行HPLC檢測(cè)，三次重復(fù)，根據(jù)回歸方程計(jì)算齊墩果酸和熊果酸總提取率。

1.2.4.2正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化在單因素考察基礎(chǔ)上，在超聲波輔助提取條件下，分別以乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因素為考察對(duì)象，以齊墩果酸和熊果酸總提取率為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，通過正交實(shí)驗(yàn)以優(yōu)化提取工藝。4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表如下：

表1　齊墩果酸和熊果酸正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1　The orthogonal designing factors and levels table for OA and UA

1.2.5數(shù)據(jù)處理供試品進(jìn)樣得到齊墩果酸和熊果酸峰面積，根據(jù)齊墩果酸和熊果酸的回歸方程分別計(jì)算齊墩果酸和熊果酸的提取率，然后相加就得齊墩果酸和熊果酸的總提取率。即公式：：齊墩果酸提取率（％）=（AU-13324）V/5000000，熊果酸提取率（％）=（AU-10756）V/4000000，AU表示樣品峰面積值；V表示合并后濾液體積。三次取平均值就得最后齊墩果酸和熊果酸的總提取率，然后用Excel繪制曲線。

標(biāo)準(zhǔn)偏差：計(jì)算出三次齊墩果酸和熊果酸的總提取率，然后在Excel中工具欄“公式”中STDEV進(jìn)行計(jì)算，就得到標(biāo)準(zhǔn)誤差，然后繪制誤差線。

2　結(jié)果與分析

2.1齊墩果酸和熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，齊墩果酸的回歸曲線如圖1所示，其線性回歸方程為：Y=5000000X+13324，R2=0.9830。結(jié)果表明齊墩果酸在進(jìn)樣濃度0.059～0.296mg·mL-1范圍內(nèi)，峰面積和樣品濃度的線性關(guān)系良好。熊果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，其線性回歸曲線為：Y=4000000X+10756，R2=0.9920。結(jié)果表明熊果酸在進(jìn)樣濃度0.0315～0.315mg·mL-1范圍內(nèi)，峰面積和樣品濃度的線性關(guān)系良好。

圖1　齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of OA

圖2　熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　The standard curve of UA

圖3　齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.3　The standard of OA chromatogram

2.2OA和UA標(biāo)準(zhǔn)品與分離晶體色譜檢測(cè)結(jié)果

由圖3可知，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品在10.00min時(shí)有峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間確定樣品中齊墩果酸的峰面積，從而計(jì)算出齊墩果酸提取率。

圖4　熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.4　The standard of UA chromatogram

由圖4可知，熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品在10.64min時(shí)有峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間確定樣品中熊果酸的峰面積，從而計(jì)算出熊果酸提取率。

圖5　提取方法對(duì)OA和UA總提取率的影響Fig.5　Effect of extraction methods on the total extraction rate of OA and UA

2.3單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1提取方法對(duì)OA和UA總提取率的影響如圖5可知，超聲波輔助提取方法對(duì)齊墩果酸和熊果酸總提取率最高，而且操作簡(jiǎn)單，所以選用超聲波輔助提取。

圖6　溶劑濃度對(duì)OA和UA總提取率的影響Fig.6　Effect of solvent concentration on the total extraction rate of OA and UA

2.3.2提取溶劑濃度對(duì)OA和UA總提取率的影響如圖6可知，隨著乙醇濃度的增加，齊墩果酸和熊果酸總提取率隨之增加，95%達(dá)到最大。99%甲醇的提取率比95%乙醇總提取率稍高，但是由于甲醇對(duì)人體具有毒性，所以95%乙醇為最佳提取溶劑。

2.3.3料液比對(duì)OA和UA總提取率的影響如圖7可知，隨著料液比的增加，齊墩果酸和熊果酸的總提取率也隨著增加。當(dāng)料液比為1∶5時(shí)，齊墩果酸和熊果酸的總提取率為1.506%；當(dāng)料液比為1∶10時(shí)，齊墩果酸和熊果酸的總提取率為1.592%；當(dāng)料液比大于1∶10時(shí)，齊墩果酸和熊果酸總提取率反而下降，這可能是因?yàn)樵谔崛〉倪^程中，木瓜皮渣的質(zhì)量固定，隨著溶劑的增加，超聲波的穿透能力下降，故而齊墩果酸和熊果酸總提取率反而下降，選取料液比為1∶10。

2.3.4提取時(shí)間對(duì)OA和UA總提取率的影響如圖8可知，隨著提取時(shí)間的增加，齊墩果酸和熊果酸的總提取率也隨著增加。50min時(shí)，齊墩果酸和熊果酸總提取率為1.448%；超聲提取60min時(shí)，齊墩果酸和熊果酸總提取率為1.453%，增長(zhǎng)緩慢；超聲提取70min時(shí)，總提取率不增長(zhǎng)；當(dāng)時(shí)間為80min時(shí)，齊墩果酸和熊果酸總提取率為1.441%，反而下降，這可能是由于齊墩果酸和熊果酸提取時(shí)間過長(zhǎng)，一些糖類和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)慢慢溶出，使得溶液粘度增大，齊墩果酸和熊果酸被吸附在固體基質(zhì)上而不易被提取出來。綜合考慮產(chǎn)品的收益與效率，選擇超聲提取50min最佳。

圖7　料液比對(duì)OA和UA總提取率的影響Fig.7　Effect of solid-liquid ratio on the total extraction rate of OA and UA

圖8　提取時(shí)間對(duì)OA和UA總提取率的影響Fig.8　Effect of extraction time on the total extraction rate of OA and UA

圖9　提取溫度對(duì)OA和UA總提取率的影響Fig.9　Effect of temperature on the total extraction rate of OA and UA

2.3.5提取溫度對(duì)OA和UA總提取率的影響如圖9可知，隨著溫度的升高，齊墩果酸和熊果酸總提取率也在不斷的升高。當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí)，齊墩果酸和熊果酸總提取率為0.851%；溫度為70℃時(shí)總提取率為0.852%，增長(zhǎng)緩慢；80℃時(shí)總提取率反而下降，這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的高溫加熱使部分齊墩果酸和熊果酸發(fā)生氧化或分解反應(yīng)。所以超聲提取水浴的最佳溫度為60℃。

2.4正交實(shí)驗(yàn)

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度都不同程度地影響著皺皮木瓜皮渣中齊墩果酸和熊果酸總提取率。因此，正交實(shí)驗(yàn)以乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取溫度4種因素，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析見表2。

表2　齊墩果酸和熊果酸總提取率的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2　Results and analysis of orthogonal test for the total rate of OA and UA

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果、極差分析可以看出：各因素對(duì)齊墩果酸和熊果酸總提取率的影響程度由高到低依次為C＞A＞B＞D，即提取時(shí)間＞乙醇濃度＞料液比＞提取溫度，所以提取時(shí)間對(duì)總提取率的影響最大。料液比與溶劑濃度對(duì)其總提取率亦有顯著影響，提取溫度影響顯著性最低。綜合考慮成本與效率，最佳配比為A3B3C3D3（即乙醇濃度95%，料液比1∶15，提取時(shí)間50min，提取溫度70℃）。在此工藝條件下皺皮木瓜齊墩果酸和熊果酸總提取率達(dá)1.607%。

表3為齊墩果酸和熊果酸總提取率方差分析，結(jié)果表明：A、B、C對(duì)齊墩果酸和熊果酸總提取率的影響顯著，并且各因素對(duì)齊墩果酸和熊果酸總提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。由各因素的影響程度分析，各因素的F值可以反映出各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的重要性。F值越大，表明對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響越大，即重要性越大。由表3可知，F(xiàn)A=157.000，F(xiàn)B=133.000，F(xiàn)C= 168.400，F(xiàn)D=1.000，即各因素對(duì)齊墩果酸和熊果酸總提取率的影響為提取時(shí)間＞乙醇濃度＞料液比＞提取溫度。

3　結(jié)論

通過單因素結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了皺皮木瓜中齊墩果酸和熊果酸的提取工藝。確定最佳提取工藝條件為95%乙醇，料液比1∶15，提取時(shí)間50min，提取溫度70℃。在此工藝條件下，齊墩果酸和熊果酸總提取率達(dá)1.607%。

表3　齊墩果酸和熊果酸總提取率的方差分析Table 3　Analysis of variance for the total rate of OA and UA

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Study on the conditions of extracting oleanolic acid and ursolic acid from residue of Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai

CAI Juan，LIU Shi-yao，WEI Zheng-xin，ZHANG Dan，PAN Xue-zhen，BIAN Jing-jun，BAI Zhi-chuan*
（College of Horticulture and Landscape Agriculture，Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions，Ministry of Education，Southwest University，Chongqing 400715，China）

To optimize the extracting technology for oleanolic acid and ursolic acid from residue of Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai.The orthogonal test was based on single factor and used to optimize oleanolic acid and ursolic acid with detecting the targeted component index by high performance liquid chromatography（HPLC）.It showed that the best extraction conditions were as follows：the solvent concentration 95%ethanol，the ratio of materials to solution 1∶15（g∶mL），the extracting time 50min，the extracting temperature 70℃，and the yield was 1.607%.The method of extracting by the experiment was stable and reliable，and easy to operate，and the result could provide reference data for industrial production of extracting OA and UA from Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai.

HPLC；oleanolic acid；ursolic acid；Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai

TS255.1

B

1002-0306（2015）02-0282-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.052

2014－04－14

蔡娟（1989-），女，碩士研究生，研究方向：經(jīng)濟(jì)植物生物技術(shù)。

白志川（1956-），女，碩士研究生，教授，研究方向：中草藥藥用植物研究、經(jīng)濟(jì)植物生物技術(shù)。

重慶科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（CSTC，2009AC1180）。