孫玉霞，蔣錫龍，史紅梅，管雪強，王恒振（.山東省農業(yè)科學院農產品研究所，山東濟南5000；.山東省葡萄研究院，山東濟南5000）

葡萄枝條提取物的抑菌活性及其在紅地球葡萄防腐保鮮上的應用研究

孫玉霞1，蔣錫龍2，史紅梅2，管雪強1，王恒振1
（1.山東省農業(yè)科學院農產品研究所，山東濟南250100；2.山東省葡萄研究院，山東濟南250100）

采用微量肉湯稀釋法研究了葡萄枝條提取物對供試3種真菌和5種細菌的最小抑菌濃度（MIC），結果表明葡萄枝條提取物對真菌和細菌均有一定的抑菌活性；為進一步明確葡萄枝條提取物在葡萄防腐保鮮中的應用，以紅地球葡萄為試材，分別以葡萄枝條提取物、殼聚糖及葡萄枝條提取物與殼聚糖復合溶液作為保鮮劑，研究了其對葡萄防腐保鮮的作用效果，結果表明葡萄枝條提取物與殼聚糖復合涂膜處理能夠降低葡萄的失水率、保持可溶性固形物含量和含酸量等品質指標，同時對降低果皮上真菌和細菌菌落總數(shù)作用顯著（p＜0.05）。

葡萄枝條，提取物，抑菌活性，保鮮

葡萄是世界上產量最大的水果之一，因其酸甜可口、營養(yǎng)和保健價值豐富而深受人們的喜愛。但是葡萄皮薄多汁，自然條件下保鮮期較短，為此國內外研究人員做了大量的工作以解決這一問題，如二氧化硫、二氧化氯、仲丁胺等保鮮劑的使用；以及臭氧處理、低溫貯存和氣調貯存等。由于常用的防腐保鮮劑的化學殘留對人體健康和環(huán)境污染存在潛在風險，因此，來自植物自身的天然抑菌成分日益受到重視，如蘆薈提取物［1］、丹皮酚及其白芷多糖包合物［2］、蒲公英綠原酸及其包合物［3］等，此外殼聚糖（chitosan，簡稱CTS）作為一種天然的聚合物糖類，由于能夠有效地提高植物的抗病性或延長水果的保鮮期［4］也被廣泛地應用于葡萄的保鮮研究中［5-6］。

葡萄枝條作為栽培過程中修剪下的廢棄物，其中含有豐富的多酚類物質，作者已對葡萄枝條提取物的多酚含量、種類及抗氧化活性做過系統(tǒng)研究［7］，本研究繼續(xù)對其抑菌活性及其在葡萄防腐保鮮上的應用進行相關實驗，以紅地球葡萄為試材，進行采后葡萄枝條提取物及其與殼聚糖的復合處理，通過對葡萄品質指標和果皮上真菌、細菌菌落總數(shù)的分析，研究其對葡萄保鮮防腐的作用效果，以期找到一種適用于葡萄防腐保鮮的新技術，延長葡萄的貨架期。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

葡萄品種紅地球，2012年8月采自平度市大澤山鎮(zhèn)；殼聚糖購自濟南海得貝海洋生物工程有限公司；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis subsp.subtilis）、綠膿桿菌（Pseudomonasaeruginosa）、灰綠青霉（Penicillium glaucum）、黑曲霉（Aspergillus niger）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus subsp.aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）均由山東大學微生物技術國家重點實驗室提供；乳酸菌（Oenococcus oeni）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 法國Lallemand公司，將所有供試的菌種接入相對應的試管斜面培養(yǎng)基上，每種菌接三支重復，細菌置37℃恒溫培養(yǎng)18～24h，霉菌、酵母培養(yǎng)28℃恒溫培養(yǎng)44～48h；細菌平板培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，成分為蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂15g/L，pH7.2～7.6，121℃高壓滅菌20min；真菌平板培養(yǎng)基孟加拉紅培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術有限公司產品，成分為葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氫鉀1g/L，硫酸鎂0.5g/L，氯霉素0.1g/L，瓊脂18.4g/L，孟加拉紅0.033g/L，121℃高壓滅菌20min。

YXQG02手提式電熱壓力蒸汽消毒器山東新華安得醫(yī)療用品有限公司；SW-CJ-ZD超凈工作臺蘇州凈化設備有限公司；WYT-32型手持糖量計泉州光學儀器廠；GSP-9160MBE型隔水式恒溫靜置培養(yǎng)箱上海博迅實業(yè)有限公司；HZQ-Q全溫振蕩器哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1葡萄枝條提取物制備修剪下的葡萄枝條經干燥粉碎后過40目篩，用50%乙醇水溶液60℃振蕩提取1h，提取3次，合并濾液，5000r/min離心后50℃減壓濃縮，再經大孔樹脂純化并真空干燥后得葡萄枝條提取物。

1.2.2防腐保鮮劑制備葡萄枝條提取物溶液：將葡萄枝條提取物用少量50%乙醇溶解后用蒸餾水稀釋，配制成64mg/L（以沒食子酸含量計，福林-肖卡法）溶液，記為G。

殼聚糖溶液：將殼聚糖用1%（V/V）的乙酸溶液溶解，再用1mol/L的NaOH調節(jié)pH至中性，配制成0.5%（W/V）的殼聚糖溶液，并攪拌均勻，記為C。

復合防腐保鮮劑：將葡萄枝條提取液用上述0.5%（W/V）的殼聚糖溶液稀釋，配制成64mg/L溶液，記為GC。

1.2.3葡萄處理方法選擇無腐爛霉變、成熟度和穗型較一致的新鮮葡萄，隨機分成4組，每組5穗，在不同濃度的保鮮劑中浸泡2min，取出自然晾干，以不浸果為對照，室溫下放置于塑料筐中。每個濃度的保鮮劑平行處理3組，每隔2d取樣測定其可溶性固形物、含酸量、失水率等品質指標及真菌和細菌菌落數(shù)。

1.2.4測定方法MIC測定方法：采用微量肉湯稀釋法［8］。培養(yǎng)基制備同常量肉湯稀釋法，將倍比稀釋后不同濃度的提取液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第7孔加液，每孔10μL，第8孔不加提取液作為生長對照。將菌懸液經MH肉湯1∶1000稀釋后，向每孔中加100μL，密封后置35℃培養(yǎng)箱中，孵育24h判斷結果。當對照孔內細菌明顯生長，以在小孔內完全抑制細菌生長的最低提取液物濃度為MIC。

可溶性固形物：以手持式糖量計測定折光糖度計。

含酸量：酸堿滴定法測定［9］。

失水率（%）：（初始果重-貯存后果重）/初始果重×100。

菌落數(shù)：從每組3個平行果穗上各剪下2個果粒，稱重后，置于100mL無菌0.9%NaCl中，浸泡10min，每2min搖動1次，將果粒表皮菌落充分洗下。取1mL含菌水加入裝有9mL無菌0.9%NaCl的試管中（此時稀釋倍數(shù)為10-3），相同操作稀釋至10-4倍。從10-3倍稀釋液中取0.1mL加入細菌平板，從10-4倍釋液中取0.1mL加入真菌平板（各做2個平行），涂布均勻。細菌37℃靜置培養(yǎng)24h，真菌28℃靜置培養(yǎng)72h，計數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS18.0軟件，多組間比較用One-Way ANOVA法。

2　結果與討論

2.1葡萄枝條提取液的MIC

葡萄枝條提取液對供試的5種細菌（枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳酸菌）和3種真菌（灰綠青霉、黑曲霉、釀酒酵母）均有明顯的抑制作用，最低抑菌濃度見表1。該提取液對真菌的抑菌效果略好于對細菌的抑菌效果，對黑曲霉和釀酒酵母的MIC最低為16mg/L；其次為灰綠青霉、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和乳酸菌，均為32mg/L；對綠膿桿菌和大腸桿菌的MIC為64mg/L。但在李春麗等［10］對芒果核多酚抑菌活性的研究中，提取物對細菌的抑菌效果較好，而對真菌無明顯抑制效果；郝少麗等［11］亦報道蘋果渣多酚純化物對細菌的抑制作用較強，而對供試霉菌、酵母菌抑制作用不明顯，這可能是與提取物成分的差異有關。葡萄枝條提取物對真菌的抑制作用為其在果蔬防腐保鮮上的應用提供了理論依據(jù)，也據(jù)此選取64mg/L為保鮮實驗的提取物含量。

表1　葡萄枝條提取液的MIC測定結果Table 1　MIC results of the extract from grape cane

2.2不同處理對葡萄貯存期間失水率的影響

由圖1可知，與對照組相比，保鮮劑處理均可降低葡萄果實失水率。雖然在開始的第3d，各處理的失水率相差不大，可是隨著儲存時間的延長，葡萄枝條提取物與殼聚糖復合保鮮劑的效果越明顯。在貯存時間到達15d后，用葡萄枝條提取物與殼聚糖復合處理的葡萄失水率為13.10%，而對照組的葡萄失水率已達14.23%。這是因為葡萄經處理后可在表面形成一層無色透明的薄膜，阻止了水分蒸發(fā)，從而降低呼吸作用和水分的消耗。

圖1　不同處理對葡萄貯存期間失水率的影響Fig.1　Changes of the evaporate ratio in grape fruit during storage

2.3不同處理對葡萄可溶性固形物和含酸量的影響

葡萄中的可溶性固形物主要包括葡萄糖、果糖等，其含量是決定葡萄營養(yǎng)價值和口感的一個重要指標。葡萄的含酸量也是決定葡萄品質的一個重要指標，主要的有機酸包括酒石酸、蘋果酸、檸檬酸等。另一方面，葡萄中的有機酸為其代謝活動中的基本物質，因此貯存期間葡萄含酸量的變化是反映營養(yǎng)物質消耗程度的重要指標。

由圖2和圖3可見：在常溫貯存期間，經過處理的葡萄和對照組葡萄的可溶性固形物含量和含酸量隨時間的延長均逐漸升高。但經過保鮮劑處理的葡萄升高的速度明顯降低，各處理的可溶性固形物含量和含酸量均明顯低于對照，其中以葡萄枝條提取物和殼聚糖復合處理的葡萄的可溶性固形物含量和含酸量變化幅度最少，分別上升3.4%和0.67g/L；而未經保鮮劑處理的葡萄可溶性固形物上升4.8%、含酸量升高0.97g/L。這是因為經涂膜處理后的葡萄失水率降低，而且由于保鮮劑的作用降低了果實的呼吸消耗，使得葡萄因失水造成可溶性固形物含量和含酸量增加。

圖2　不同處理葡萄儲存期間可溶性固形物含量的變化Fig.2　Changes of the soluble solid contents in grape fruit during storage

圖3　不同處理葡萄儲存期間含酸量的變化Fig.3　Changes of the titratable acids in grape fruit during storage

2.4不同處理對葡萄貯存期間果皮表面真菌和細菌菌落數(shù)的影響

不同處理的葡萄儲存3～15d表皮細菌和真菌菌落總數(shù)見圖4和圖5所示，經過保鮮劑處理的葡萄在儲存期間的菌落總數(shù)均低于對照，但不同處理之間差異較大。貯存15d后，相比對照的細菌菌落總數(shù)11.89×104cfu/g，僅用葡萄枝條提取液處理的葡萄細菌菌落總數(shù)為9.76×104cfu/g；而經殼聚糖涂膜和葡萄枝條提取物與殼聚糖復合涂膜處理的細菌菌落總數(shù)分別為2.38×104cfu/g和1.51×104cfu/g，僅為對照的20.02%和12.70%。

圖4　不同處理葡萄儲存期間細菌菌落總數(shù)的變化Fig.4　Changes of the total number of bacterial colonies in grape fruit during storage

儲存15d后未經處理的葡萄真菌菌落總數(shù)為15.22×105cfu/g，僅用葡萄枝條提取液處理的葡萄真菌菌落總數(shù)為7.78×105cfu/g；而經殼聚糖涂膜和葡萄枝條提取物與殼聚糖復合涂膜處理的真菌菌落總數(shù)分別為1.63×105cfu/g和0.92×105cfu/g，僅為對照10.71%和6.04%。由此可見，僅用葡萄枝條提取液作為保鮮劑，與對照相比雖然有一定的抑菌效果，但不如其與殼聚糖符合涂膜處理的抑菌效果顯著（p＜0.05）。這是因為殼聚糖亦能有效地抑制細菌和真菌的生長和繁殖［12］，與同樣具有抑菌作用的葡萄枝條提取液復合使用，可以達到更好的保鮮防腐效果。從圖4和圖5可以看出，貯存期間葡萄枝條提取液與殼聚糖復合涂膜處理比單一保鮮劑處理的抑菌效果顯著提高（p＜0.05）。

圖5　不同處理葡萄儲存期間真菌菌落總數(shù)的變化Fig.5　Changes of the total number of fungal colonies in grape fruit during storage

3　結論

從MIC實驗結果可知葡萄枝條提取物對真菌和細菌均有一定的抑制作用，但其葡萄防腐保鮮應用實驗結果顯示，該提取物對真菌的抑菌活性要好于其對細菌的抑菌活性。采用葡萄枝條提取物、殼聚糖、該提取物與殼聚糖復合涂膜均對葡萄常溫儲存具有一定的防腐保鮮作用，其中以葡萄枝條提取液與殼聚糖復合涂膜處理對葡萄儲存期間的保鮮防腐效果最為顯著（p＜0.05），優(yōu)于單獨使用葡萄枝條提取物、殼聚糖處理。使用該復合保鮮劑能較好地保持葡萄常溫儲存期間的果實品質，且作為天然的植物來源制劑，無毒無副作用，具有實際應用價值，并為農業(yè)廢棄資源的綜合利用提供了廣闊的應用前景。

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Anti-microbial activity of grape cane extracts and its application on storage of Red Globe grape

SUN Yu-xia1，JIANG Xi-long2，SHI Hong-mei2，GUAN Xue-qiang1，WANG Heng-zhen1
（1.Institute of Agro-Food Science and Technology，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Ji’nan 250100，China；2.Shandong Grapevine Institute，Ji’nan 250100，China）

Micro broth dilution method was employed to investigate the minimal inhibitory concentration（MIC）of the grape cane extracts to 3 kinds of fungi and 5 kinds of bacteria.The results showed that the grape cane extracts had significant effect on inhibiting the activities of selected microorganisms.In order to acquire more information about the application of grape cane extracts on table grape storage，compared the preservative effect of three substrates，i.e.grape cane extracts，chitosan，and the mixture of above two substrates on table grape（Vitis vinifera L.cv.Red Globe）.It was found that preservative films smearing with grape cane extracts and chitosan efficiently prevented the clusters from serious dehydration，helped sustain the soluble solid content and titratable acidity of berries，and significantly reduced（p＜0.05）the total plate count of fungi and bacteria on the berry surface.

grape cane；extract；anti-microbial activity；preservation

TS255.3

A

1002-0306（2015）02-0129-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.020

2014－05－07

孫玉霞（1973-），女，碩士研究生，副研究員，研究方向：釀酒技術及風味物質研究。

山東省農業(yè)重大應用創(chuàng)新課題。