高丹丹，郭鵬輝，祁高展，溫海超（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030）

響應面法優(yōu)化薄荷全草總黃酮的提取工藝

高丹丹，郭鵬輝，祁高展，溫海超
（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030）

以薄荷為材料，采用超聲波輔助法提取薄荷全草總黃酮，研究乙醇體積分數(shù)、超聲波處理時長、料液比、水浴溫度對提取率的影響，在單因素實驗的基礎上，采用響應面法優(yōu)化薄荷全草總黃酮的提取工藝條件，得最佳提取工藝，即：乙醇體積分數(shù)50%、料液比1∶20、水浴溫度50℃、超聲波提取時間30min，在此工藝下總黃酮提取率為3.11%± 0.06%。

薄荷，總黃酮，超聲波，響應面法

薄荷（Mentha haplocalyx）為被子植物門、雙子葉植物綱、唇形目、唇形科、薄荷屬多年生宿根性草本植物，主要生長于水旁、潮濕地，對環(huán)境適應性較強。薄荷是一味傳統(tǒng)中藥，可治療感冒發(fā)熱、喉痛、頭痛、目赤痛、皮膚風疹搔癢、麻疹不透等癥，此外對癰、疽、疥、癬、漆瘡亦有效［1］。薄荷可制作菜肴，做涼拌菜和烤肉的調(diào)味料，可作食品添加劑，用于糖果、清涼食品飲料、牙膏、漱口水、噴霧香精等制品［2］。研究表明薄荷的水提物對酪氨酸酶有較好的激活作用，能促進毛發(fā)中黑色素的生成，有烏發(fā)作用，可用于化妝品［3］。薄荷提取物成分還有防曬［4］、抗衰老、去臭以及清涼作用，并能對某些細菌抑制其繁殖和殺死部分細菌及霉菌，故對于頭癢和頭屑過多的癥狀有一定的治療作用［7］。薄荷中黃酮類化合物具有抗氧化［5］、抗腫瘤及抑菌作用［6］。由于薄荷黃酮有多種生物活性，成為研究和開發(fā)利用的熱點。目前國內(nèi)對薄荷黃酮提取的研究報道的不多，有研究采用正交的方法優(yōu)化了薄荷總黃酮的提取工藝［7-9］，侯學敏等［10］采用響應面法優(yōu)化薄荷葉總黃酮提取工藝，并研究其抗氧化活性。他們的研究獲得較高的黃酮提取率，但是他們采用四因素三水平的響應面分析，最終模型的R2為0.8327，擬合度不是很好。在實際的生產(chǎn)和開發(fā)中，人們大多采用機器收割的方式獲得薄荷全草，獲得薄荷葉的成本較高，本研究在單因素的基礎上采用響應面法對薄荷全草總黃酮提取工藝進行優(yōu)化，去掉對實驗影響不顯著的因素，使得模型的擬合度更好，獲得更加可信的工藝條件，為薄荷進一步研究及開發(fā)利用，提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

野生薄荷全草采自江西吉安井岡山；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、乙醇均為國產(chǎn)分析純；蘆丁標準品購自阿拉丁公司。

微型植物試樣粉碎機北京科偉永興儀器有限公司；FAZ204B型電子天平上海精密科學儀器有限公司；酒精計河北省河間市黎民居標準儀表廠；HWS28型電熱恒溫水浴鍋上海一恒科學儀器有限公司；超聲波清洗機上海聲彥超聲波儀器有限公司；水流抽氣機上海愛朗儀器有限公司；722E型可見分光光度計上海光譜儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品預處理將薄荷全草（水分含量4.72%）用微型植物試樣粉碎機粉碎，過60目篩備用。

1.2.2總黃酮含量的測定

1.2.2.1蘆丁標準曲線制備準確稱取5.0mg蘆丁標準品，用30%乙醇溶解，定容至50mL，配成0.1mg/mL蘆丁標準溶液。精密移取0.0、1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mL蘆丁標準溶液置于10mL比色管中，用30%乙醇溶液定至5.0mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，靜置6min；加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，靜置6min；加入1mol/L氫氧化鈉溶液4mL，用30%乙醇定容至10.0mL，靜置15min。在510nm處測定其吸光度，繪制蘆丁標準曲線。

1.2.2.2樣品測定準確移取1mL待測樣品于10mL比色管中，加30%乙醇溶液定容至5mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，靜置6min；加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，靜置6min；加入1mol/L氫氧化鈉溶液4mL，用30%乙醇定至10.0mL，靜置15min，在510nm處測定其吸光度。根據(jù)蘆丁標準曲線，按下式計算樣品中總黃酮的提取率：

式中，C：標準曲線計算得到的總黃酮濃度（mg/mL）；V1：待測液總體積（mL）；V2：測試液定容體積（mL）；V3：測試液體積（mL）；M：稱取薄荷樣品的質(zhì)量（g）。

1.2.3單因素實驗

1.2.3.1料液比對提取率的影響準確稱取1.0000g薄荷置于試劑瓶中，分別加入10、20、30、40、50mL的50%乙醇溶液，60℃恒溫水浴1h，超聲處理40min，抽濾，加乙醇溶液定容100mL，按1.2.2方法測定其提取率，每組實驗重復三次。

1.2.3.2乙醇體積濃度對提取率的影響準確稱取1.0000g薄荷置于試劑瓶中，分別加入30%、40%、50%、60%、70%體積濃度的乙醇溶液20mL，在60℃恒溫水浴鍋中水浴1h，放入超聲波清洗機中超聲處理40min，抽濾，加乙醇溶液定容100mL，按1.2.2方法測定其提取率，每組實驗重復三次。

1.2.3.3水浴溫度對提取率的影響準確稱取1.0000g薄荷置于試劑瓶中，加入50%乙醇溶液20mL，分別在40、50、60、70、80℃恒溫水浴鍋中水浴1h，放入超聲波清洗機中超聲處理40min，抽濾，加乙醇溶液定容100mL，按1.2.2方法測定其提取率，每組實驗重復三次。

1.2.3.4超聲時間對提取率的影響準確稱取1.0000g薄荷置于試劑瓶中，加入50%乙醇溶液20mL，60℃恒溫水浴1h，放入超聲波清洗機中，分別超聲處理20、30、40、50、60min，抽濾，加乙醇溶液定容100mL，按1.2.2方法測定其提取率，每組實驗重復三次。

1.2.4響應面實驗設計根據(jù)單因素實驗得到的結(jié)果，采用響應面法設計實驗，運用Box-Behnken的中心組合實驗，選擇對薄荷總黃酮提取具有顯著影響的三個因素：乙醇濃度（A）、水浴溫度（B）和超聲時間（C），采用三因素三水平的響應面實驗設計，見表1。

1.2.5數(shù)據(jù)分析采用F檢驗對響應面實驗數(shù)據(jù)進行方差分析以評價模型的統(tǒng)計意義，數(shù)據(jù)分析軟件采用Design Expert 8.0。

2　結(jié)果與分析

2.1標準曲線繪制

蘆丁標準曲線以蘆丁標準溶液的濃度為橫坐標，以吸光度A為縱坐標，繪制蘆丁標準品的散點圖，制得如圖1所示，回歸方程為：y=14.401x+0.0066，R2= 0.999。表明蘆丁標準品在濃度為0.01～0.05mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

圖1　蘆丁標準曲線Fig.1　The standard curve of Rufin

2.2單因素分析

2.2.1料液比對薄荷總黃酮提取率的影響由圖2可知，薄荷總黃酮提取率在料液比1∶10～1∶20之間，料液比增加，總黃酮提取率隨之增加，這可能是因為增加溶劑，增加了薄荷粉與溶劑接觸面的濃度差，提高了傳質(zhì)速率［7］。在超聲波提取下，當增加溶劑時，細胞破碎完全，總黃酮充分溶解。

料液比達到1∶20以后，薄荷中總黃酮已經(jīng)充分溶解，提取率趨于穩(wěn)定，總黃酮提取率隨料液比增加而趨于穩(wěn)定。當料液比達到1∶50時，總黃酮提取率稍有減少。可能是由于溶劑過多時，有可能使其他物質(zhì)滲出，使溶液黏度增加，影響薄荷黃酮的提取。同時，溶劑使用量較大，溶劑本身對超聲波有一定的吸收損耗［11］?？紤]到節(jié)約溶劑和提取效率，選擇料液比為1∶20為最佳提取料液比。

圖2　料液比對薄荷總黃酮提取的影響Fig.2　The effect of the liquid material rate on total flavonoids yield

2.2.2乙醇體積濃度對薄荷總黃酮提取率的影響由圖3可知，乙醇體積分數(shù)30%～50%之間，隨著乙醇體積分數(shù)增加，總黃酮提取率增加。由于薄荷中黃酮類化合物的溶解度因結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)（苷或苷元、單糖苷、雙糖苷或三糖苷）不同而有很大差異。一般游離的黃酮苷元難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙醚等有機溶劑及稀堿液中；黃酮類化合物在羥基糖苷化后，水溶性相應加大，在有機溶劑中溶解度則相應減少。黃酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇、稀堿液等強極性溶劑中［12］。薄荷中含有大量的黃酮苷類物質(zhì)，使用較大極性的溶劑提取效果較好。50%乙醇體積分數(shù)溶劑總黃酮提取率達到最高，可能是50%乙醇溶劑既有利于以苷類形式存在的大部分黃酮類物質(zhì)浸出，又有利于一些游離的黃酮類物質(zhì)浸出［13］。之后隨著乙醇體積分數(shù)增加，提取率減少，同時提取液顏色變化明顯。這可能是乙醇體積分數(shù)過高，薄荷中色素、脂溶性物質(zhì)、糖類及黏性物質(zhì)等物質(zhì)大量滲出［14］，影響總黃酮提取，同時破壞了總黃酮的穩(wěn)定性。故本實驗選擇50%乙醇體積分數(shù)，作為響應面實驗的中心點。

圖3　乙醇濃度對薄荷總黃酮提取的影響Fig.3　The effect of the ethanol concentration on total flavonoids yield

2.2.3水浴溫度對薄荷總黃酮提取率的影響由圖4可知，當水浴溫度在40～60℃之間，隨著溫度升高，薄荷總黃酮提取率增大，可能是溫度升高加快了分子熱運動速度和提高了總黃酮滲透擴散溶解能力，加快物質(zhì)的溶出，但雜質(zhì)也易被提取出［15］。

水浴溫度達到60℃以后，總黃酮提取率趨于穩(wěn)定，總黃酮幾乎完全浸出，溶劑達到飽和。當水浴溫度超過70℃以后，總黃酮提取率逐漸降低，可能溫度過高，總黃酮組織結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性被破壞，氧化分解，總黃酮含量降低。同時，溫度過高，溶劑揮發(fā)，造成溶劑損失，影響薄荷總黃酮提取效果。本實驗選擇60℃水浴溫度作為響應面實驗的中心點。

圖4　水浴溫度對薄荷總黃酮提取的影響Fig.4　The effect of bath temperature on total flavonoids yield

2.2.4超聲時間對薄荷總黃酮提取率的影響由圖5可知，超聲時間20～40min之間，隨著時間增加，總黃酮提取率逐漸增加，主要由于超聲波產(chǎn)生強烈的空化效應、機械振動、乳化、擴散、擊碎和攪拌作用，擊破植物細胞膜，增大物質(zhì)分子運動頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而增加了溶劑向細胞內(nèi)擴散，加速薄荷中總黃酮進入溶劑。同時，超聲波的熱效應使水溫基本在57℃左右，對原料起到了水浴加熱的作用［16］。

圖5　超聲時間對薄荷總黃酮提取的影響Fig.5　The effect of ultrasonic treatment time on total flavonoids yield

超聲波處理在開始段，時間與有效物質(zhì)的提取率呈正相關，在達到一定時間后提取效果不再明顯，由于隨著時間增加，超聲波對細胞膜破碎作用進一步加大，粘液等雜質(zhì)相應增加，使浸提液粘度增大，擴散速度降低，影響總黃酮提取率［17］。當超聲時間達到40min以后，總黃酮提取率有所降低，可能超聲波處理時間過長，總黃酮被破壞，同時超聲時間增加，溫度也隨之升高，總黃酮穩(wěn)定性降低。隨著超聲時間的增加，一部分黃酮類化合物被超聲波分解［18］，選擇30、40、50min超聲時間，進行響應面優(yōu)化實驗。

2.3薄荷總黃酮響應面實驗分析

2.3.1多元二次模型方程的建立與檢驗薄荷總黃酮提取的響應面分析實驗選取3個對提取效果影響較顯著的因素：乙醇濃度（A）、水浴溫度（B）和超聲時間（C），根據(jù)Box-Beknhen中心組合實驗設計原理，設計三因素三水平的響應面實驗。實驗設計了17組實驗，其中包括5組中心點重復實驗，每組實驗平行重復三次，數(shù)據(jù)結(jié)果如表2所示。

表2　Box-Behnken實驗設計及實驗數(shù)據(jù)結(jié)果Table 2　Box-Behnken design matrix and the experimental result

利用Design Expert 8.0軟件對表2中的實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到薄荷總黃酮提取的回歸方程為：Y=3.102+0.17125A+0.005B-0.08625C-0.18225A2-0.05975B2-0.05725C2+0.065AB+0.0225AC+0.105BC。

對響應面多元二次模型進行方差分析，分析結(jié)果如表3所示。從表3數(shù)據(jù)中可知，本實驗所選用的二次多項模型p=0.0002＜0.01，說明該模型二次方程極顯著，表明本實驗方法是可靠的，該方程對模擬真實的三因素三水平的分析是可行的［19］。模型失擬項在α=0.05水平上不顯著（p=0.8716＞0.05），說明未知因素對本實驗的結(jié)果干擾小，其R2為0.9703說明該二次多項模型93.20%的響應值的變化能解釋，有總變異的6.80%不能用該二次多項模型來解釋，表明該模型的擬合度好，用此模型可以對薄荷總黃酮提取工藝進行優(yōu)化。

表3　二次多項模型方差分析結(jié)果Table 3　Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model

對該回歸方程的回歸系數(shù)進行顯著性檢驗，其結(jié)果如表4所示。可知，一次項A（p＜0.01）和C（p＜0.01），二次項A2（p＜0.01）和C2（p＜0.01）均在1%的水平內(nèi)顯著（極顯著），二次項B2（p＜0.05）在5%的水平內(nèi)顯著，表明在薄荷總黃酮提取工藝過程中，乙醇濃度和超聲時間對總黃酮提取有極其顯著的影響。交互項BC（p＜0.01）在1%的水平內(nèi)顯著（極顯著），AB（p＜0.05）在5%的水平內(nèi)顯著，表明水浴溫度和超聲時間的交互作用對總黃酮的提取有極其顯著的影響，乙醇濃度和水浴溫度的交互作用對總黃酮的提取也有顯著的影響。

表4　回歸方程系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果Table 4　Regression coefficients and their significance of the quadratic model

圖6　乙醇濃度與水浴溫度交互作用影響總黃酮提取率的曲面圖Fig.6　Response surface plot for the effects of variables on the total flavonoids yield versus ethanol concentration and bath temperature

2.3.2響應面分析和優(yōu)化通過響應面二次多項模型方程的建立，得出響應面的曲面圖，如圖6～圖8所示。通過動態(tài)圖可分析和評價任意兩種因素的交互作用影響總黃酮提取率的效應，還可以從圖中確定最佳因素的水平范圍。等高線的形狀反映出交互作用影響效應的強弱與大小，橢圓形表示兩種因素的交互作用影響顯著，而圓形則表示兩種因素的交互作用影響不顯著［20］。

由圖6可以看出乙醇濃度與水浴溫度對總黃酮提取率的交互作用的影響效應。從等高線圖可知，乙醇濃度與水浴溫度的交互作用影響顯著。將超聲時間固定在0水平時，總黃酮提取率隨著乙醇濃度的增加而先增加后降低，當乙醇濃度達到55%時達最大值后開始降低?？傸S酮提取率隨著水浴溫度的升高而增加，從圖6中也可以乙醇濃度對提取率的曲線較為陡峭，說明在提取過程中乙醇濃度的對提取率的影響大于水浴溫度。

圖7 乙醇濃度與超聲時間交互作用影響總黃酮提取率的曲面圖Fig.7　Response surface plot for the effects of variables on the total flavonoids yield versus ethanol concentration and ultrasonic treatment time

圖7表示乙醇濃度與超聲時間對薄荷總黃酮提取率的交互作用的影響效應。其等高線圖表明乙醇濃度與超聲時間的交互作用影響不顯著。當把水浴溫度固定在0水平，隨著超聲時間的增加，提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在40min，總黃酮提取率達到最大點，隨著時間增加，而略有降低，可能由于超聲波對細胞膜破碎作用進一步加大，粘液等雜質(zhì)相應增加，使浸提液粘度增大，擴散速度降低，影響總黃酮提取率。

圖8　水浴溫度與超聲時間交互作用影響總黃酮提取率的曲面圖Fig.8　Response surface plot for the effects of variables on the total flavonoids yield versus bath temperature and ultrasonic treatment time

圖8反映了水浴溫度與超聲時間對薄荷總黃酮提取率的交互作用的影響效應。從圖8中的等高線圖及曲面圖可知，水浴溫度與超聲時間這兩種因素對總黃酮提取率的交互作用影響十分顯著。當乙醇濃度固定在0水平上，隨著水浴溫度的增大，總黃酮提取率呈增大趨勢。隨超聲時間的增加，總黃酮提取率先增加后減小。水浴溫度為60℃，超聲時間為40min時，薄荷總黃酮提取率獲得最大值。

2.3.3模型驗證實驗根據(jù)Box-Behnken實驗得到的結(jié)果以及二次多項回歸方程，并利用Design Expert 8.0軟件，獲得本實驗薄荷總黃酮提取率最高時的各因素的最佳提取條件為乙醇體積分數(shù)50%、水浴溫度50℃、超聲時間30min。在此條件下，薄荷總黃酮提取率為3.17%。對此優(yōu)化提取條件進行驗證實驗，重復進行三次，測得薄荷總黃酮提取率為3.06%、3.18%和3.09%，平均值為3.11%±0.06%，與理論計算值的誤差在±1%以內(nèi)，該模型能較好地預測實際的薄荷總黃酮提取情況。

3　結(jié)論

通過乙醇溶劑提取薄荷中總黃酮，輔助超聲波提取，采用可見分光光度計法測定總黃酮含量，以乙醇濃度、液料比、水浴溫度和超聲提取時間為因素，通過單因素實驗和響應面實驗優(yōu)化提取工藝，采用乙醇體積分數(shù)50%、料液比1∶20、水浴溫度50℃和超聲時間30min的條件，測得井岡山野生薄荷全草的總黃酮提取率在3.11%±0.06%，優(yōu)化后得到的預測結(jié)果與實驗結(jié)果較吻合。與同類研究相比，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的薄荷總黃酮含量有很大的差異，不同采摘期薄荷中黃酮含量也不一樣［21］。本研究為薄荷黃酮類化合物的利用提供理論依據(jù)，為提高薄荷的綜合利用價值奠定基礎。

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Optimization of extraction technology of total flavonoids from Mentha haplocalyx by response surface methodology

GAO Dan-dan，GUO Peng-hui，QI Gao-zhan，WEN Hai-chao
（College of Life Science and Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030，China）

Ultrasonic-assisted method was used to extract the total flavonoids from Mentha haplocalyx，and the effects of ethanol concentration，ultrasonic treatment time，solid-liquid ratio and bath temperature on the extraction rate of total flavonoids were investigated.On the basis of single factor tests，the extraction technology of total flavonoids from Mentha haplocalyx was optimized by response surface methodology.The optimum conditions obtained were as follows：ethanol concentration was 50%，extraction time was 30min，solid-liquid ratio was 1∶20 and bath temperature was 50℃.Under this conditions，the extraction rate values of total flavonoids was 3.11%±0.06%.

Mentha haplocalyx；total flavonoids；ultrasonic；response surface methodology

TS255.1

B

1002-0306（2015）02-0299-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.056

2014－05－21

高丹丹（1983-），女，博士研究生，副教授，研究方向：食品生物技術(shù)。

西北民族大學中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金（31920130047）。