史美榮，李　華，白　鴿，肖婭萍（藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室，陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

HPLC法測定絞股藍(lán)中5種皂苷成分的含量

史美榮，李華，白鴿，肖婭萍*
（藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室，陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

目的：HPLC法比較不同地區(qū)絞股藍(lán)中人參皂苷Rb1、Rb3、Rd和絞股藍(lán)皂苷XLIX、XVII的含量。方法：采用Shimpack C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈和水，流速為0.8mL·min-1，檢測波長為203nm，柱溫為25℃。結(jié)果：采自陜西灃峪口的絞股藍(lán)樣品中人參皂苷Rb1、Rb3和Rd的含量最高，約為1.625%，1.776%，0.892%；云南普洱樣品所含的絞股藍(lán)皂苷XLIX最高，約為1.75%；重慶北碚區(qū)-1的樣品中XVII的含量最高，約為1.063%。結(jié)論：各地區(qū)絞股藍(lán)樣品中皂苷含量差異很大。

絞股藍(lán)，人參皂苷，絞股藍(lán)皂苷，HPLC

絞股藍(lán)［Gynostemmapentaphyll um（Thunb.）Makino］為葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草質(zhì)藤本植物，又名七葉膽［1］，主要分布于我國秦嶺和長江流域以南廣大地區(qū)［2］。絞股藍(lán)中約有皂苷140多種，其中皂苷III、IV、VIII、XII與人參皂苷-Rb1、-Rb3、-Rd、-F2完全相同［3-4］，具有降血糖、降血脂、降血壓、增強(qiáng)免疫等藥理活性［5-8］。文獻(xiàn)報(bào)道的絞股藍(lán)皂苷含量分析方法很多［9-14］，但采用HPLC法同時(shí)測定絞股藍(lán)藥材中人參皂苷Rb1、Rb3、Rd及絞股藍(lán)皂苷XLIX、XVII 5種皂苷類化合物的研究尚未見報(bào)道。為了更好地對(duì)絞股藍(lán)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，從而對(duì)其進(jìn)行深入的開發(fā)，本研究建立了同時(shí)測定絞股藍(lán)中人參皂苷Rb1、Rb3、Rd、絞股藍(lán)皂苷XLIX、XVII的含量的HPLC方法，并采用該方法比較不同地區(qū)絞股藍(lán)中5種皂苷的含量，為絞股藍(lán)的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

絞股藍(lán)采自陜西、云南、四川、湖北等地，經(jīng)陜西師范大學(xué)植物教研室田先華教授鑒定為葫蘆科絞股藍(lán)屬植物絞股藍(lán)［Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino］；乙腈美國fisher公司；正丁醇天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；對(duì)照品Rb1、Rb3、Rd、絞股藍(lán)皂苷XLIX、XVII成都曼斯特生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)分別為13102301、12110603、13041212、13080202、13050301，純度均≥98.0%；超純水。

LC-2010高效液相色譜儀及工作站日本島津公司；Shim-pack C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱日本島津公司；KQ-300E型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海比朗儀器有限公司；AT2201電子分析天平密多利斯科學(xué)儀器北京有限公司等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取人參皂苷Rb1、Rb3、Rd和絞股藍(lán)皂苷XLIX、XVII對(duì)照品13.090、24.200、7.605、19.015、16.225mg，分別用甲醇溶解，并定溶于5mL容量瓶，即制成2.618、4.840、1.521、3.803、3.245mg·mL-1濃度的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液；分別取上述單一儲(chǔ)備液200μL，混合后制成質(zhì)量濃度分別為0.524、0.968、0.304、0.760、0.649mg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

1.2.2供試品溶液的制備取不同產(chǎn)地的絞股藍(lán)新鮮全草，晾干，粉碎處理后，經(jīng)85目的篩子過濾，從中準(zhǔn)確稱取約0.5g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇30mL，超聲處理（功率250W，頻率100kHz）40min，提取液減壓蒸干，殘?jiān)铀芙猓盟柡驼〈驾腿纱?，合并萃取液，減壓蒸干，以甲醇定容至10mL，搖勻，用微孔濾膜（0.22μm）過濾，即得［15］。

1.2.3高效液相色譜條件色譜柱：Shim-pack C18（4.6mm×250mm，5μm）；柱溫：25℃；流速：0.8mL·min-1；流動(dòng)相：A為水，B為乙腈；洗脫條件：0min，35%B；0～20min，35%～40%B；檢測波長：203nm；進(jìn)樣量：20μL。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制分別精密吸取“1.2.1”項(xiàng)下的Rb1、Rb3、Rd、XLIX、XVII單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，將Rb1分別稀釋成0.13、0.65、1.30、1.95、2.60μg/μL，Rb3分別稀釋成0.04、1.20、2.40、3.60、4.80μg/μL，Rd分別稀釋成0.076、0.380、0.760、1.140、1.520μg/μL，XLIX分別稀釋成0.125、1.250、1.875、2.500、3.750μg/μL，XVII分別稀釋成0.053、0806、1.613、2.419、3.225μg/μL，用孔徑0.22μm的濾膜過濾后，置于樣品瓶中，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，按照上述色譜條件進(jìn)行HPLC測定，作峰面積對(duì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線回歸方程。

2　結(jié)果與分析

2.1粉末粒度的選擇

對(duì)不同的粉末粒度，即篩子孔徑65、85、120、200目提取效果進(jìn)行比較。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)當(dāng)粒度為85目時(shí)提取效率最高，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用85目的篩子處理樣品。

2.2儀器條件的選擇

選擇乙腈和水作為流動(dòng)相梯度洗脫進(jìn)行樣品測定。結(jié)果表明各樣品與其他雜質(zhì)能夠得到很好的分離，如圖1所示。

圖1　絞股藍(lán)對(duì)照品（A）和平利-1（B）色譜圖Fig.1　HPLC chromatograms of reference substances（A）and Pingli-1（B）

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線

在規(guī)定的色譜條件下，將“1.2.4”項(xiàng)下的各標(biāo)準(zhǔn)液系列進(jìn)樣20μL進(jìn)行測定，各標(biāo)準(zhǔn)液均有良好的線性關(guān)系，其結(jié)果如表1所示。

表1　對(duì)照品的線性關(guān)系（n=5）Table 1　Regression equations of reference substances（n=5）

2.4方法學(xué)考察

2.4.1精密度實(shí)驗(yàn)取湖北鶴峰供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果人參皂苷Rb1、Rb3、Rd、絞股藍(lán)皂苷XLIX、XVII峰面積的RSD（n=6）分別為1.82%、0.83%、1.25%、0.31%、1.01%，表明該方法具有良好的精密度。

2.4.2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取湖北竹溪供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣測定各成分的峰面積值。結(jié)果人參皂苷Rb1、Rb3、Rd、絞股藍(lán)皂苷XLIX、XVII峰面積的RSD（n=6）分別為1.90%、2.01%、1.32%、0.72%、0.95%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)分別稱取陜西平利-1的樣品5份，分別測其含量。結(jié)果人參皂苷Rb1、Rb3、Rd、絞股藍(lán)皂苷XLIX、XVII的含量平均值（n=5）0.398%、0.639%、0.292%、0.213%、0.766%；RSD分別為1.81%、1.94%、0.77%、2.16%、1.58%，表明該方法重復(fù)性好。

2.4.4準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)以加樣回收率考察準(zhǔn)確度。取已知含量（人參皂苷Rb1、Rb3、Rd、絞股藍(lán)皂苷XLIX、XVII）的陜西平利絞股藍(lán)粉末5份，每份0.5g，精密稱定，分別精密加入人參皂苷Rb1、Rb3、Rd、絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷XVII的對(duì)照品0.76、0.66、0.96、0.28、1.18mL，按上述色譜條件方法測定，計(jì)算五個(gè)成分的加樣回收率。結(jié)果上述5個(gè)分析物的平均回收率分別為98.46%、101.63%、102.63%、99.15%、98.48%；RSD分別為0.85%、1.01%、2.32%、1.65%、2.25%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性。

2.5樣品測定結(jié)果

采用本實(shí)驗(yàn)所建立的方法對(duì)32批來自陜西，云南，廣西等不同產(chǎn)地的絞股藍(lán)樣品中人參皂苷Rb1、Rb3、Rd和絞股藍(lán)皂苷XLIX、XVII的含量進(jìn)行測定，該方法適用于絞股藍(lán)及其制品的測定，結(jié)果如表2所示。測定結(jié)果表明，32批采自不同地區(qū)樣品的皂苷成分在組成和含量上存在一定的差異，這種差異可能與地區(qū)差異有關(guān)。另外絞股藍(lán)植株為雌雄異株，其葉型可分為3、5、7、9，另外其染色體倍數(shù)也混雜，這些均可能影響絞股藍(lán)皂苷含量和種類。本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品中的皂苷成分進(jìn)行相關(guān)分析，可為今后絞股藍(lán)皂苷的變化規(guī)律以及影響因素方面的相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。

表2　32批絞股藍(lán)藥材中5種皂苷成分的含量測定結(jié)果Table 2　The determination results of the five saponins in 32 samples

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測定絞股藍(lán)中人參皂苷Rb1、Rb3、Rd、絞股藍(lán)皂苷XLIX、XVII含量的HPLC方法，該方法具有分離效果好，回收率好，精密度高，儀器要求不高，靈敏度高的特點(diǎn)。且實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb3在絞股藍(lán)樣品中含量高，且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，故可作為絞股藍(lán)皂苷含量測定的對(duì)照品之一，這為多指標(biāo)控制絞股藍(lán)藥材的質(zhì)量提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Quantification of five saponins in Gynostemma Pentaphyllum（Thunb.）Makino by HPLC

SHI Mei-rong，LI Hua，BAI Ge，XIAO Ya-ping*
（Key Laboratory of Ministry of Education for Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry，National Engineering Laboratory for Resource Developing of Endangered Chinese Crude Drugs in Northwest of China，College of Life Sciences，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

Objective：To compare the content of Saponins in Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino from different regions.Methods：The HPLC separation was carried out with a C18column（4.6mm×250mm，5μm）using acetonitrile and water as mobile phase at a flow rate of 0.8mL·min-1.The detection wavelength was 203nm and the column temperature was maintained at 25℃.Results：The material collected from Fengyukou in Shaanxi had the highest content of ginsenoside Rb1，Rb3and Rd，about 1.625%，1.776%，0.892%respectively. The material from Pu’er in Yunnan contained the highest Gyp（Gypenoside）XLIX，approximately 1.75%.The material from Chongqing Beibei-1 had the highest content of Gyp XVII，about 1.063%.Conclusion：There was a significant difference in the content of Saponins in Gynostemma pentaphyllum from the different areas.

Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino；ginsenoside；gypenoside；HPLC

TS255.1

A

1002-0306（2015）02-0049-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.001

2014－04－14

史美榮（1989-），女，碩士研究生，研究方向：藥用植物資源。

肖婭萍（1958-），女，博士研究生，教授，研究方向：藥用植物資源。

國家“十二五”科技支撐計(jì)劃課題（660588）。