何小慶　柳　芳　許　雯　何美蓉

sAPRIL結(jié)合肽對(duì)LOVO細(xì)胞5-FU化療敏感性的影響

何小慶1柳芳2許雯2何美蓉2

目的增殖誘導(dǎo)配體（APRIL）與結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶（5-FU）的耐藥性密切相關(guān)。我們前期已利用噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)成功篩選并人工合成與sAPRIL有高親和力的結(jié)合肽。本研究旨在探討sAPRIL結(jié)合肽對(duì)結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞5-FU化療敏感性的影響。方法將LOVO細(xì)胞分為PBS組、5-FU組、sAPRIL結(jié)合肽+5-FU組。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡。結(jié)果5-FU組和sAPRIL結(jié)合肽+5-FU組增殖抑制率分別為（37.62±7.07）%、（63.05±2.15）%；流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組的細(xì)胞周期顯示5-FU組阻滯在S期，sAPRIL結(jié)合肽+5-FU組阻滯在G0/G1期和S期，且S期阻滯效應(yīng)顯著強(qiáng)于5-FU組；三組細(xì)胞凋亡率分別為（0.21±0.09）%、（12.80±0.30）%、（17.1± 0.66）%。結(jié)論sAPRIL結(jié)合肽能增強(qiáng)結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞對(duì)5-FU的化療敏感性，有望成為結(jié)直腸癌靶向治療的新型候選制劑。

結(jié)直腸癌；增殖誘導(dǎo)配體；5-氟尿嘧啶；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

增殖誘導(dǎo)配體（a proliferation-inducing ligand，APRIL）是TNF超家族的一個(gè)新成員，在正常組織中表達(dá)很弱，但在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中過(guò)表達(dá)［1］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)APRIL過(guò)表達(dá)與結(jié)直腸癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及對(duì)5-FU耐藥性密切相關(guān)［2］。因而，設(shè)法降低APRIL的生物活性則有望抑制大腸癌細(xì)胞的增殖，延緩腫瘤的轉(zhuǎn)移并提高其對(duì)5-FU的化療敏感性。近年來(lái)，分子靶向治療的出現(xiàn)，為治療腫瘤提供了強(qiáng)有力的手段。在前期研究中，我們通過(guò)噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)篩選和鑒定出高親和力的sAPRIL結(jié)合肽，其氨基酸序列為AAAPLAQHMA。本研究旨在探討sAPRIL結(jié)合肽對(duì)結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞的5-FU化療敏感性的影響。

材料與方法

一、材料和試劑

1.實(shí)驗(yàn)材料

人結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

2.主要試劑

5-氟尿嘧啶（上海旭東海普藥業(yè)公司）；sAPRIL結(jié)合肽（杭州中肽生物技術(shù)公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibcol公司）；CCK-8試劑盒、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LOVO細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104/mL，每孔100滋L RPMI 1640完全培養(yǎng)基含2×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔；第2日每組分別PBS、5-FU、（sAPRIL結(jié)合肽+5-FU）處理48 h之后，加入CCK-8試劑10滋L/孔孵育4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度（A）值。按下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值）×100%。

2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

(二)張慧劍《明清江蘇文人年表》、江慶柏《清代人物生卒年表》均依據(jù)《歷代名人生卒年表補(bǔ)》謂金門(mén)詔“生于康熙十一年，卒于乾隆十六年”。如前所言，《表補(bǔ)》將生年定為“康熙十二年”而非“康熙十一年”，張、江均引用有誤，且《表補(bǔ)》卒年考訂本誤。

收集各組不同處理后的LOVO細(xì)胞1×106/個(gè)，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗細(xì)胞兩次，加入預(yù)冷70%乙醇，4℃固定過(guò)夜后離心棄掉上清，用PBS洗細(xì)胞1次，加入碘化丙啶染色液重懸細(xì)胞沉淀，37℃避光溫浴30 min后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集各組不同處理后的LOVO細(xì)胞1×106/個(gè)，用PBS洗滌2次，離心棄掉上清，加入195滋L Annexin V-FITC（20～25℃）結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，再加入5滋L Annexin V-FITC室溫避光孵育10 min。離心棄上清，加入190滋L Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，再加入10滋L碘化丙啶染色液混勻后隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。多組間差異采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、sAPRIL結(jié)合肽對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的影響

二、sAPRIL結(jié)合肽對(duì)細(xì)胞周期分布的影響

采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，與PBS組相比，5-FU組細(xì)胞周期阻滯在S期，sAPRIL結(jié)合肽+ 5-FU組細(xì)胞阻滯在G0/G1和S期，且S期阻滯效應(yīng)比5-FU組更明顯（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

三、sAPRIL結(jié)合肽對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率，PBS組、5-FU組、（sAPRIL結(jié)合肽+5-FU）組細(xì)胞凋亡率分別為（0.21±0.09）%、（12.80±0.30）%、（17.1±0.66）%。（sAPRIL結(jié)合肽+5-FU）組的凋亡率顯著高于另外兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

討論

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤之一，全球結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率均位于所有惡性腫瘤的第3位［3］。5-FU作為單藥或聯(lián)合用藥至今仍是結(jié)直腸癌患者的一線治療藥物，但因患者易對(duì)其產(chǎn)生耐藥及副作用大，總體有效率較低。因此，如何提高5-FU化療敏感性、逆轉(zhuǎn)耐藥一直是臨床面臨解決的重要問(wèn)題［4］。

APRIL是腫瘤壞死因子超家族的一個(gè)新成員，其通過(guò)與特異性受體結(jié)合，參與促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞增殖及加速腫瘤形成等多個(gè)過(guò)程［5］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，APRIL過(guò)表達(dá)與結(jié)直腸癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及對(duì)5-FU耐藥性密切相關(guān)。鑒于多肽類制劑具有合成和純化操作簡(jiǎn)便、免疫原性低、滲透力強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)［6-8］，因此，尋找特異性sAPRIL結(jié)合肽，以之阻斷APRIL與其受體結(jié)合，通過(guò)抑制APRIL的生物活性，提高5-FU對(duì)結(jié)直腸癌的化療敏感性是本研究的主要內(nèi)容。

腫瘤的形成是由于細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡之間的平衡發(fā)生了破壞，因此，抑制細(xì)胞增殖或者誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡成為治療腫瘤的最根本的途徑［9-10］。本研究表明，（sAPRIL結(jié)合肽+5-FU）組的細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞周期S期阻滯效應(yīng)顯著高于單藥5-FU組；另外，（sAPRIL結(jié)合肽+5-FU）組誘導(dǎo)早期細(xì)胞凋亡率也明顯高于單藥5-FU組。

圖1　流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

圖2　流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

本研究已經(jīng)從抑制結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)LOVO細(xì)胞凋亡兩方面驗(yàn)證sAPRIL結(jié)合肽可提高5-FU對(duì)LOVO細(xì)胞的化療敏感性。在后期的實(shí)驗(yàn)中，我們將檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白及細(xì)胞凋亡蛋白等相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步闡明sAPRIL結(jié)合肽提高結(jié)直腸癌對(duì)5-FU化療敏感性的分子機(jī)制。sAPRIL結(jié)合肽有望成為APRIL過(guò)表達(dá)結(jié)直腸癌的靶向治療的新型候選制劑。

1Moreaux J，Veyrune J L，De Vos J，et al.APRIL is overexpressed in cancer：link with tumor progression.BMC Cancer，2009，9：83.

2關(guān)婧，孫愛(ài)民，王莉慧，等.慢病毒介導(dǎo)RNAi抑制大腸癌細(xì)胞APRIL表達(dá)對(duì)化療敏感性的影響.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（9）：1600-1604.

3Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2012.CA Cancer J Clin，2012，62（1）：10-29.

4Zhang N，Yin Y，Xu SJ，et al.5-Fluorouracil：mechanisms of resistance and reversal strategies.Molecules，2008，13（8）：1551-1569.

5Petty RD，Samuel LM，Murray GI，et al.APRIL is a novel clinical chemo-resistance biomarker in colorectal adenocarcinoma identified by gene expression profiling.BMC Cancer，2009，9：434.

6Li ZJ，Cho CH.Peptides as targeting probes against tumor vasculature for diagnosis and drug delivery.J Transl Med，2012，10（Suppl 1）：S1.

7Vessillier S，Adams G，Montero-Melendez T，et al.Molecular engineering of short half-life small peptides（VIP，MSH and 3MSH）fused to latency-associated peptide results in improved anti-inflammatory therapeutics.Ann Rheum Dis，2011，71（1）：143-149.

8Borghouts C，Kunz C，Groner B.Current strategies for the development of peptide-based anti-cancer therapeutics.J Pept Sci，2005，11（11）：713-726.

9Mason EF，Rathmell JC.Cell metabolism：an essential link between cell growth and apoptosis.Biochim Biophys Acta，2011，1813（4）：645-654.

10 Gomes CC，Duarte AP，Diniz MG，et al.Review article：Current concepts of ameloblastoma pathogenesis.J Oral Pathol Med，2010，39（8）：585-591.

A proliferation-inducing ligand-binding peptide improves chemo-sensitivity of 5-FU on colorectal LO－VO cells

HE Xiao-qing1，LIU Fang2，XU Wen2，HE Mei-rong2.
1）The First Department of Chemotheraphy，Wuzhou Red Cross Hospital，Guangxi Zhuang Autonomous Region，543002；
2）Department of Gastroenterology，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515

Objective This study aimed to verify if the sAPRIL-binding peptide can enhance chemosensitivity of 5-FU on colorectal cancer cells.Methods LOVO cells were divided into three groups：PBS，5-FU，and sAPRIL-binding peptide plus 5-FU.The cell growth inhibition rate was detected by CCK-8 assay，and the cell cycle and cell apoptosis were detected by flow cytometry.Results The cell growth inhibition rate was（0±0）%in PBS group，（37.62±7.07）%in 5-FUgroup，（63.05±2.15）%in sAPRIL-binding peptide plus 5-FU group，respectively.In 5-FU group，cell cycle was arrested at S phase；and in sAPRIL-binding peptide plus 5-FU group，in sAPRIL-binding peptide plus 5-FU group，cell cycle was arrested at both G0/G1 and S phases（more markedly at S phase compared with 5-FU alone）.The percentage of early apoptotic cells was（0.21±0.09）%in PBS group，（12.80±0.30）%in 5-FUgroup，and（17.1±0.66）%in sAPRIL-binding peptide plus 5-FU group，respectively.Conclusions The sAPRIL-binding peptide can enhance chemo-sensitivity of 5-FU on colorectal cancer LOVO cells.This peptide might be a new approach for molecular targeted therapy of colorectal cancer.

Colorectal cancer；A proliferation-inducing ligand；5-fluorouracil；Cell proliferation；Cell apoptosis

2014-12-08）

（本文編輯：肖冰）

10.3969/j.issn.1672-2159.2015.04.006

1 543002梧州市紅十字會(huì)醫(yī)院化療科一區(qū)；2 510515南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科

何美蓉，E-mail：hemr@263.net