王　玲，田　鳳，徐　路，陶苗苗

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

響應(yīng)面法優(yōu)化南美白對(duì)蝦復(fù)合生物保鮮工藝的研究

王玲，田鳳，徐路，陶苗苗

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面（RSM）分析，研究三種復(fù)合生物保鮮劑對(duì)南美白對(duì)蝦冷藏保鮮效果的影響。以冷藏6d的南美白對(duì)蝦細(xì)菌總數(shù)為考核指標(biāo)，并采用Design-Expert軟件對(duì)復(fù)合生物保鮮劑與細(xì)菌總數(shù)之間建立的二次回歸模型進(jìn)行分析，獲得三種復(fù)合生物保鮮劑的最優(yōu)濃度組合。結(jié)果表明：三種復(fù)合生物保鮮劑的最佳使用濃度為Nisin 0.04g/100mL、ε-PL 0.48g/100mL和TP 1.06g/100mL，細(xì)菌總數(shù)理論值為1.81×103CFU/g，三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)細(xì)菌總數(shù)最多為1.98×103CFU/g，誤差僅為9.39%，說(shuō)明模型合適可信，可以用來(lái)分析和預(yù)測(cè)南美白對(duì)蝦冷藏保鮮期間的細(xì)菌總數(shù)。該復(fù)合生物保鮮劑可以相互補(bǔ)充，協(xié)同抗菌，有效延長(zhǎng)南美白對(duì)蝦的貨架期。

南美白對(duì)蝦，復(fù)合生物保鮮，響應(yīng)面優(yōu)化

南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）學(xué)名凡納濱對(duì)蝦，是世界三大對(duì)蝦養(yǎng)殖品種之一，且產(chǎn)量位居三大對(duì)蝦之首。南美白對(duì)蝦因其營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，礦物質(zhì)和維生素含量豐富等特點(diǎn)，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者喜愛(ài)。由于南美白對(duì)蝦的蛋白質(zhì)和水分含量較高，使它在捕撈后極易被微生物感染而腐敗變質(zhì)［1］，目前已有的對(duì)蝦保鮮方法盡管有多種［2］，但都存在著不同程度的化學(xué)保鮮法安全性問(wèn)題或深凍導(dǎo)致的食品品質(zhì)改變等問(wèn)題，因此，研究對(duì)蝦的安全保鮮技術(shù)對(duì)于提高對(duì)蝦品質(zhì)，促進(jìn)貿(mào)易具有重要意義。

生物保鮮劑是指從動(dòng)物、植物、微生物中提取的天然的或利用生物工程技術(shù)改造而獲得的保鮮劑。它具有抑菌性強(qiáng)、安全性和穩(wěn)定性好、抑菌范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，某些生物保鮮劑還具有一定的營(yíng)養(yǎng)特性，在保鮮的同時(shí)還能改善食品的品質(zhì)，提高產(chǎn)品附加值［3］。但是，對(duì)蝦食品中的微生物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類繁多，某一單一的生物保鮮劑由于其特定的抑菌譜的限制而難以達(dá)到全面抑菌的理想效果，通過(guò)不同保鮮劑之間的組合，不僅可以降低單一保鮮劑的用量，還可以使不同的生物保鮮劑相互補(bǔ)充，協(xié)同抗菌，全面抑制腐敗菌的生長(zhǎng)，以較安全、經(jīng)濟(jì)和高效的方式來(lái)延長(zhǎng)南美白對(duì)蝦的貨架期。

響應(yīng)曲面法（Response Surface Methodology，RSM）采用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，能以較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)和時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行全面的分析，精確地表述因子和響應(yīng)值之間的關(guān)系，建立關(guān)系模型，確定各因子及其交互作用在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)非獨(dú)立變量的影響，并可以有效、快速地確定多因素系統(tǒng)的最佳條件［4］。RSM現(xiàn)已廣泛應(yīng)用在工藝優(yōu)化控制領(lǐng)域［5-6］。本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法中的Box-Behnken設(shè)計(jì)，以南美白對(duì)蝦冷藏6d后的細(xì)菌總數(shù)為考察指標(biāo)，研究生物保鮮劑對(duì)南美白對(duì)蝦的冷藏保鮮效果，將保鮮劑和細(xì)菌總數(shù)之間的關(guān)系函數(shù)化，定量分析預(yù)先篩選過(guò)的三種生物保鮮劑各自及彼此之間的交互作用對(duì)對(duì)蝦細(xì)菌總數(shù)的影響，并獲得三種保鮮劑的最佳濃度組合，在節(jié)約成本的同時(shí)延長(zhǎng)對(duì)蝦的貨架期。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鮮活南美白對(duì)蝦在夏季（水溫27℃）蝦塘捕撈，加氧保活運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后加冰猝死，挑選體長(zhǎng)10cm左右，單體重15g左右的對(duì)蝦去頭洗凈，分組，每組180g左右；南美白對(duì)蝦冷藏期間的腐敗菌G-菌：希瓦氏菌屬（Shewanella spp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas spp.）、氣單胞菌屬（Aeromonas spp.）、黃桿菌屬（Flavobacterium spp.）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter spp.）、腸桿菌屬（Enterobacteriaceae spp.）；G+菌：乳酸菌（Lactic acid bacteria）、葡萄球菌屬（Staphylococcus spp.）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium spp.）、微球菌屬（M icrococcus spp.） 以上細(xì)菌均由本實(shí)驗(yàn)室之前從（4±1）℃冷藏的南美白對(duì)蝦中分離并經(jīng)鑒定而得；乳酸鏈球菌素（Nisin） 活力≥1200U/g，浙江銀象生物技術(shù)有限公司；聚賴氨酸（ε-PL） 純度≥95%，河南豫中生物技術(shù)有限公司；茶多酚（TP） 多酚含量≥98%，河南豫中生物技術(shù)有限公司；食品保鮮袋聚乙烯PE，脫普日用化學(xué)品（中國(guó)）有限公司；NaCl、檸檬酸、冰醋酸、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水1000m L，pH7.0～7.2）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、平板計(jì)數(shù)瓊脂國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SW-CJ-2F型雙面垂直超凈工作臺(tái)、HPX-9162MBE型電熱恒溫培養(yǎng)箱、HH.S11-2型電熱恒溫水浴鍋均為上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；101-3-BS-Ⅱ型電熱鼓風(fēng)干燥箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；LS-B50L型高壓蒸汽滅菌鍋上海華線醫(yī)用核子有限公司；HZQ-F160型恒溫振蕩培養(yǎng)箱常州諾基儀器有限公司；722S型可見(jiàn)分光光度計(jì)上海儀電科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1三種生物保鮮劑對(duì)冷藏南美白對(duì)蝦腐敗菌的最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定采用宋丹［7］的二倍稀釋法稍作改進(jìn)，分別測(cè)定不同保鮮劑對(duì)南美白對(duì)蝦冷藏保鮮期腐敗菌的M IC。先將Nisin、ε-PL和TP分別配制成較高濃度的母液，然后在比色皿中用無(wú)菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基以二倍法稀釋成連續(xù)的5個(gè)濃度，接入細(xì)菌濃度為5×105CFU/m L的菌懸液1m L，120r/m in、（30±1）℃條件下振蕩培養(yǎng)12h，期間每隔2h在600nm波長(zhǎng)處測(cè)定一次光密度（OD值），每次均以無(wú)菌培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)零，觀察光密度的變化，以O(shè)D值不變的最小濃度為該保鮮劑對(duì)該腐敗菌的最小抑菌濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。

1.2.2單因素實(shí)驗(yàn)以1.2.1中生物保鮮劑對(duì)冷藏南美白對(duì)蝦腐敗菌的最小抑菌濃度為依據(jù)，將三種保鮮劑以不同的方法分別配制成不同的濃度梯度，具體為：用pH為2.0的檸檬酸溶液將Nisin配制成濃度為5%的母液，然后用無(wú)菌蒸餾水稀釋成0.02、0.03、0.04、0.05和0.06g/100m L 5個(gè)濃度梯度；將ε-PL用無(wú)菌蒸餾水配制成濃度為5%的母液，然后同樣的方法繼續(xù)稀釋成0.2、0.3、0.4、0.5和0.6g/100m L 5個(gè)濃度梯度；將TP用無(wú)菌蒸餾水加熱溶解配制成濃度為2%的母液，然后同樣的方法稀釋成5個(gè)濃度梯度：0.8、0.9、1.0、1.1和1.2g/100m L 5個(gè)濃度梯度。接著將經(jīng)預(yù)處理并分組的南美白對(duì)蝦分別于上述各濃度梯度的保鮮液中浸泡5m in，撈起適當(dāng)瀝干水后用食品保鮮袋包裝，于（4±1）℃條件下冷藏，時(shí)間為6d，然后按國(guó)標(biāo)GB/T 4789.2-2010［8］的方法測(cè)定細(xì)菌總數(shù)。用無(wú)菌蒸餾水代替保鮮液作空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。

1.2.3響應(yīng)面法優(yōu)化南美白對(duì)蝦復(fù)合生物保鮮劑的使用濃度根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)Nisin、ε-PL和TP三種生物保鮮劑的使用濃度進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1，以保鮮劑浸泡5m in、撈起瀝干水并（4±1）℃冷藏6d后的南美白對(duì)蝦細(xì)菌總數(shù)為響應(yīng)值（實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值），采用Design-Expert 7.1.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，建立數(shù)學(xué)模型，并用最小二乘法擬合，參照文獻(xiàn)［9］建立二次多項(xiàng)式方程為：

式中：Y為響應(yīng)值（細(xì)菌總數(shù)）；A0為常數(shù)項(xiàng)，Ai為線性系數(shù)，Aii為二次項(xiàng)系數(shù)，Aij為交互項(xiàng)系數(shù)；Xi和Xj為自變量編碼值。

表1　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 1　Factors and levels of Box-Behnken

2　結(jié)果與討論

2.1生物保鮮劑對(duì)冷藏南美白對(duì)蝦腐敗菌MIC的影響

三種生物保鮮劑Nisin、ε-PL和TP對(duì)南美白對(duì)蝦冷藏保鮮期間分離到的10個(gè)屬的腐敗菌的最小抑菌濃度如表2所示。

表2　生物保鮮劑對(duì)冷藏南美白對(duì)蝦腐敗菌的MIC（g/100mL）Table 2　MIC of biological preservative to refrigerated P.vannamei spoilage bacteria（g/100mL）

從表2可以看出，每種生物保鮮劑都有其特定的抑菌譜，并且對(duì)不同細(xì)菌的MIC存在著較大差異。Nisin主要能抑制腐敗菌中的G+，對(duì)G+的M IC均不高于0.03g/100m L，且對(duì)表中ε-PL和TP難以抑制的棒狀桿菌有較好的抑制作用；ε-PL的抑菌譜較廣，能抑制對(duì)蝦腐敗菌中除棒狀桿菌以外的所有G+和除黃桿菌以外的所有G-；TP對(duì)部分G+和部分G-有抑制作用，對(duì)腐敗菌中的G-的M IC稍高于G+，但對(duì)G-的黃桿菌的抑制效果較好。

從以上結(jié)果可以看出，將這三種生物保鮮劑復(fù)合使用，可以使它們的抑菌性能相互補(bǔ)充，發(fā)揮協(xié)同抗菌的作用，將冷藏南美白對(duì)蝦中10個(gè)屬的腐敗菌進(jìn)行全面抑制，用較安全和較經(jīng)濟(jì)的靶向抑菌的保鮮方法來(lái)延長(zhǎng)南美白對(duì)蝦的貨架期，減少保鮮期因微生物導(dǎo)致的腐敗造成的損失［10］。

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)將南美白對(duì)蝦經(jīng)預(yù)處理后用無(wú)菌蒸餾水浸泡5min，撈起瀝干水后用食品保鮮袋包裝，在（4±1）℃條件下進(jìn)行冷藏保鮮，每天取樣檢測(cè)其細(xì)菌總數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1所示。

圖1　對(duì)蝦冷藏過(guò)程中細(xì)菌總數(shù)的變化Fig.1　Changes in bacterial amountof Penaeus Vanmamei during refrigerated storage

由圖1可知，空白處理的南美白對(duì)蝦初始含菌量為2.8×104CFU/g，在（4±1）℃條件下冷藏1d后，細(xì)菌總數(shù)減少為3.4×103CFU/g，這可能是因?yàn)槟厦腊讓?duì)蝦在溫暖的養(yǎng)殖水體環(huán)境中攜帶的某些嗜溫菌在冷藏時(shí)生長(zhǎng)受到了抑制，在這種環(huán)境下能夠存活的只有一些耐低溫的細(xì)菌。此后，隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌總數(shù)不斷增加，至第6d，南美白對(duì)蝦的細(xì)菌總數(shù)已經(jīng)上升到2.4×107CFU/g，蝦肉完全腐敗變質(zhì)，不能食用。

2.2.2Nisin對(duì)冷藏南美白對(duì)蝦細(xì)菌總數(shù)的影響按1.2.2中的方法，Nisin對(duì)南美白對(duì)蝦處理6d后的細(xì)菌總數(shù)影響結(jié)果如圖2所示。

圖2　不同濃度的Nisin對(duì)細(xì)菌總數(shù)的影響Fig.2　The effectof different concentrations of nisin to the total number of bacteria

由圖2可知，在冷藏過(guò)程中，隨著Nisin濃度的增加，細(xì)菌總數(shù)逐漸減少。當(dāng)Nisin濃度增加為0.04g/ 100m L后，隨著濃度的繼續(xù)增大，細(xì)菌總數(shù)下降的趨勢(shì)變得平緩，可能是由于濃度為0.04g/100m L的Nisin溶液已將腐敗菌中的G+全部抑制，如果繼續(xù)增大Nisin濃度，只會(huì)使溶液的pH逐漸降低，從而使pH耐受性差的細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制。從前面的表2已經(jīng)知道，Nisin不會(huì)對(duì)腸桿菌以外的其他G-產(chǎn)生抑制作用，所以細(xì)菌總數(shù)下降緩慢，因此選擇0.04g/100m L為Nisin的最佳濃度。

2.2.3ε-PL對(duì)冷藏南美白對(duì)蝦細(xì)菌總數(shù)的影響按1.2.2中的方法，ε-PL對(duì)南美白對(duì)蝦處理6d后的細(xì)菌總數(shù)影響結(jié)果如圖3所示。

圖3　不同濃度的ε-PL對(duì)細(xì)菌總數(shù)的影響Fig.3　The effectof different concentrations ofε-PL to the total number of bacteria

從圖3可以看出，隨著ε-PL濃度的增加，南美白對(duì)蝦的細(xì)菌總數(shù)呈先減少后增加的趨勢(shì)，在ε-PL濃度為0.4g/100m L時(shí)，細(xì)菌總數(shù)值最少。當(dāng)ε-PL濃度低于0.4g/100m L時(shí)，隨著濃度的增加，被抑制的細(xì)菌種類逐漸增多，所以細(xì)菌總數(shù)下降較快；當(dāng)ε-PL濃度增加到0.4g/100m L后，細(xì)菌總數(shù)反而有所增加，可能是由于ε-PL本身是一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它分解產(chǎn)生的L-賴氨酸可為細(xì)菌的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)。所以，ε-PL的最適濃度為0.4g/100m L。

2.2.4TP對(duì)冷藏南美白對(duì)蝦細(xì)菌總數(shù)的影響按1.2.2中的方法，TP對(duì)南美白對(duì)蝦處理6d后的細(xì)菌總數(shù)影響結(jié)果如圖4所示。

圖4　不同濃度的TP對(duì)細(xì)菌總數(shù)的影響Fig.4　The effectof different concentrations of TP to the total number of bacteria

由圖4可見(jiàn)，隨著TP濃度的不斷提高，細(xì)菌總數(shù)逐漸減少，當(dāng)TP濃度增加到1.0g/100m L后，細(xì)菌總數(shù)減少變得緩慢。由前面表2中TP對(duì)冷藏南美白對(duì)蝦腐敗菌的M IC可知，1.0g/100m L的TP溶液已能將抑菌譜內(nèi)的腐敗菌全面抑制，且TP具有輕微的苦澀味［11］，濃度太高會(huì)影響南美白對(duì)蝦的口感，也不利于節(jié)約成本，所以選擇1.0g/100m L為TP的最佳濃度。

2.3響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化南美白對(duì)蝦復(fù)合生物保鮮劑濃度及配比

2.3.1Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Nisin濃度0.04g/100m L、ε-PL濃度0.4g/100m L和TP濃度1.0g/100m L為冷藏南美白對(duì)蝦保鮮劑單獨(dú)作用時(shí)的最佳濃度，在此濃度下既能保證細(xì)菌總數(shù)較低，又能避免盲目增加保鮮劑的用量造成的成本增加。按照表1的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平編碼表，對(duì)Nisin、ε-PL和TP的濃度作變換，以（4±1）℃冷藏6d后的南美白對(duì)蝦的細(xì)菌總數(shù)為響應(yīng)值，對(duì)17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)5次以估計(jì)誤差，優(yōu)化南美白對(duì)蝦復(fù)合生物保鮮劑濃度的響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　復(fù)合生物保鮮劑濃度的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果Table 3　The design and results of RSM of composite biological preservative

利用Design-Expert 7.1.6軟件對(duì)表3中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到細(xì)菌總數(shù)對(duì)Nisin、ε-PL和TP三個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸模型為：

表4　回歸模型的方差分析Table 4　The variance analysis of regressionmodel

2.3.2模型的顯著性檢驗(yàn)上式回歸模型的方差分析見(jiàn)表4。從表4可知，該模型極顯著（p=0.0002），說(shuō)明用此模型來(lái)優(yōu)化南美白對(duì)蝦復(fù)合生物保鮮劑濃度是合適的，失擬項(xiàng)（p=0.0762＞0.05）不顯著，表明模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合度較好，實(shí)驗(yàn)誤差小；變異系數(shù)（C.V）=4.21%，在可接受的范圍內(nèi)，說(shuō)明模型的可信度較高；模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0.9266，相關(guān)系數(shù)R2=0.9679，表明該模型能解釋92.66%的響應(yīng)值的變化，且預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間能較好的吻合，可以用此模型來(lái)代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。對(duì)模型回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)表明，Nisin的一次項(xiàng)X1和二次項(xiàng)的一次項(xiàng)X2和二次項(xiàng)以及TP的一次項(xiàng)X3和二次項(xiàng)均顯著，說(shuō)明Nisin、ε-PL和TP都對(duì)南美白對(duì)蝦的細(xì)菌總數(shù)有顯著的影響，由一次項(xiàng)的F值可知影響的大小順序?yàn)門P＞ε-PL＞Nisin；二次項(xiàng)X1X3、X2X3顯著，說(shuō)明Nisin和TP、ε-PL和TP的交互作用是影響南美白對(duì)蝦細(xì)菌總數(shù)的重要因素。

2.3.3復(fù)合生物保鮮劑及各用量的響應(yīng)面分析根據(jù)回歸方程用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面作圖，各實(shí)驗(yàn)因素（Nisin、ε-PL和TP）之間的交互作用和響應(yīng)值（細(xì)菌總數(shù)）與各因子之間的關(guān)系如圖5～圖7所示。根據(jù)Guoyi Chi等［12］的觀點(diǎn)，響應(yīng)面圖的等高線為橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則表示不顯著，所以由響應(yīng)曲面圖及其等高線形狀可以看出不同生物保鮮劑交互作用的強(qiáng)弱。

圖5　Nisin和ε-PL的交互作用對(duì)細(xì)菌總數(shù)的影響Fig.5　Effectof interaction between Nisin andε-PL on total bacteria

圖5表示TP濃度為1.0g/100m L時(shí)Nisin和ε-PL的交互作用對(duì)南美白對(duì)蝦細(xì)菌總數(shù)的影響。由圖5可以看出，Nisin和ε-PL共同作用的等高線為圓形，說(shuō)明交互作用不顯著，兩者復(fù)合的抑菌效果與單獨(dú)作用之和沒(méi)有顯著差異。但Nisin對(duì)G+的抑制效果較好，尤其是對(duì)ε-PL和TP均不能抑制的棒狀桿菌屬有較好的抑制作用，所以雖然Nisin和ε-PL的協(xié)同抗菌作用不顯著，但對(duì)于全面抑制冷藏南美白對(duì)蝦的腐敗菌仍具有重要作用，故仍然選擇Nisin作為復(fù)合生物保鮮劑之一。

圖6　Nisin和TP的交互作用對(duì)細(xì)菌總數(shù)的影響Fig.6　Effectof interaction between Nisin and TP on total bacteria

圖6表示ε-PL濃度為0.4g/100m L時(shí)Nisin和TP的交互作用對(duì)南美白對(duì)蝦細(xì)菌總數(shù)的影響。由圖6可以看出，Nisin和TP的等高線為橢圓形，說(shuō)明Nisin和TP在抑菌效果上有顯著的交互作用，復(fù)合使用這二種生物保鮮劑能產(chǎn)生協(xié)同抗菌效應(yīng)，達(dá)到更好的抑菌效果，這也與報(bào)道的Nisin與其他生物保鮮劑混合使用能產(chǎn)生遠(yuǎn)大于自身抑菌作用的保鮮效果相吻合［13］。

圖7　ε-PL和TP的交互作用對(duì)細(xì)菌總數(shù)的影響Fig.7　Effect of interaction betweenε-PL and TP on total bacteria

圖7表示Nisin濃度為0.04g/100m L時(shí)ε-PL和TP的交互作用對(duì)南美白對(duì)蝦細(xì)菌總數(shù)的影響。由圖7可知，ε-PL和TP的等高線呈橢圓形，說(shuō)明交互作用顯著，曲面存在細(xì)菌總數(shù)最少的最低點(diǎn)。當(dāng)ε-PL和TP的濃度均較低時(shí)，隨著濃度的增加，細(xì)菌總數(shù)逐漸減少，到達(dá)最低點(diǎn)后，細(xì)菌總數(shù)又逐漸增多，可能是由于ε-PL分解產(chǎn)生的L-賴氨酸為細(xì)菌的生長(zhǎng)提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)了細(xì)菌的生長(zhǎng)，所以細(xì)菌總數(shù)反而有所增加。

通過(guò)對(duì)回歸方程求解得出南美白對(duì)蝦復(fù)合生物保鮮劑的最佳濃度配比是：Nisin0.04g/100m L、ε-PL 0.48g/100m L和TP1.06g/100m L，用此復(fù)合生物保鮮劑處理的南美白對(duì)蝦（4±1）℃冷藏6d后的細(xì)菌總數(shù)理論值為1.81×103CFU/g，處于國(guó)標(biāo)GB2733-2005［14］規(guī)定的一級(jí)鮮度以內(nèi)，說(shuō)明理論上該復(fù)合保鮮劑的保鮮效果較好，能明顯延長(zhǎng)南美白對(duì)蝦的貨架期。

2.3.4實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷尿?yàn)證和比較為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法優(yōu)化所得南美白對(duì)蝦復(fù)合生物保鮮劑使用濃度的可靠性，將上述三種生物保鮮劑按最佳濃度和配比配制混合溶液后浸泡經(jīng)預(yù)處理過(guò)的南美白對(duì)蝦5m in，撈起后適當(dāng)瀝干水分后用食品保鮮袋包裝于（4±1）℃冷藏6d，按國(guó)標(biāo)GB/T 4789.2-2010的方法測(cè)定細(xì)菌總數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果表明，用該復(fù)合生物保鮮劑冷藏保鮮的南美白對(duì)蝦平行實(shí)驗(yàn)3次測(cè)得的細(xì)菌總數(shù)分別為1.91×103CFU/g、1.85×103CFU/g和1.98×103CFU/g，均與理論值的1.81×103CFU/g接近，而且細(xì)菌總數(shù)均處于國(guó)標(biāo)GB2733-2005規(guī)定的海蝦一級(jí)鮮度范圍內(nèi)，說(shuō)明用響應(yīng)面法對(duì)南美白對(duì)蝦復(fù)合生物保鮮劑的使用濃度及配比進(jìn)行優(yōu)化是可行的。該復(fù)合生物保鮮劑不僅可以抑制南美白對(duì)蝦冷藏期間的所有腐敗菌，相互之間還具有協(xié)同抗菌的作用，減少了單一保鮮劑的用量，既節(jié)約了成本，又能明顯延長(zhǎng)南美白對(duì)蝦的貨架期。

3　結(jié)論

采用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面（RSM）分析，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，建立三種復(fù)合生物保鮮劑與細(xì)菌總數(shù)之間的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，經(jīng)驗(yàn)證該模型是合適可行的，能用于分析和預(yù)測(cè)南美白對(duì)蝦冷藏6d后的細(xì)菌總數(shù)。通過(guò)模型的響應(yīng)曲面圖及其等高線，對(duì)不同生物保鮮劑及其相互作用進(jìn)行了探討，得到復(fù)合生物保鮮劑的最佳用量和配比為Nisin0.04g/100m L、ε-PL0.48g/100m L和TP1.06g/100m L，細(xì)菌總數(shù)理論值為1.81×103CFU/g，三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌總數(shù)最多的一次為1.98× 103CFU/g，與理論值較接近，誤差僅為9.39%。因此，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化南美白對(duì)蝦復(fù)合生物保鮮劑最佳用量和配比的方法是可行的，不僅可以避免盲目增加保鮮劑的用量，降低成本，還可以明顯延長(zhǎng)南美白對(duì)蝦的貨架期，有利于促進(jìn)對(duì)蝦貿(mào)易的發(fā)展。

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Study on optim ization of Penaeus vannamei to composite of biologicalpreservation technology by response surface method

WANG Ling，TIAN Feng，XU Lu，TAO M iao-m iao
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

On the basis of sing le factor experiment，the aim was to study the influence of three kinds of compound biological p reservative on effect of cold p reservation of P.vannamei through the analysis of Box-Behnken central composite design and response surface methodology（RSM）.Using the total number of bacteria of P.vannamei which had been cold stored for 6 days as evaluation index，and using Design-Expert software to analyze the quad ratic reg ression modelof com pound biologicalp reservatives and the totalnumber of bac teria，and then op timal concentration combinations of three kinds of com pound biologicalp reservative were ob tained. The results showed that the op timal concentration of the three kinds of compound p reservative were Nisin 0.04g/100m L，ε-PL 0.48g/100m L and TP 1.06g/100m L.The total number of bacteria was 1.81×103CFU/g.The largestnumberwas 1.98×103CFU/g in the three parallelverification of totalbacteria tests，errorwas only 9.39%，which meant the modelwas app rop riate and credib le.It could be used to analyze and p redic t the totalnumber of bac teria of the P.vannamei when itwas cold stored.The com pound biologicalp reservative could be mutually com p lementary and synergistic antibac terial，which could extend the shelf life of P.vannamei effectively.

Penaeus vannamei；com posite biologicalp reservation；RSM op tim ization

TS255.46

A

1002-0306（2015）06-0337-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.065

2014-06-23

王玲（1965-），女，碩士研究生，副教授，主要從事食品加工技術(shù)及食品微生物學(xué)方面的研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31070701）。