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        組織干細(xì)胞的培養(yǎng)及定向分化實(shí)驗(yàn)

        2015-10-20 08:26:52邵志華沙繼宏呂立夏李思光
        實(shí)驗(yàn)室研究與探索 2015年1期
        關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)教學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

        邵志華, 許 潔, 沙繼宏, 呂立夏, 徐 磊,李 姣, 賈 松, 李思光

        (同濟(jì)大學(xué)a.醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞研究中心;b.醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,上海 200092)

        0 引言

        科學(xué)思維能力和解決問(wèn)題的能力是全球醫(yī)學(xué)教育的基本要求之一,也是我國(guó)進(jìn)行素質(zhì)教育與卓越醫(yī)師培養(yǎng)的目標(biāo)之一[1-3]。而實(shí)驗(yàn)教學(xué)能促進(jìn)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、解決問(wèn)題素質(zhì)的形成,引導(dǎo)他們養(yǎng)成科學(xué)思維和團(tuán)結(jié)協(xié)作精神,因此是培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力和實(shí)踐能力的有效途徑[4-5]。隨著實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的推進(jìn),高校的實(shí)驗(yàn)教學(xué)已經(jīng)突破了傳統(tǒng)單一的實(shí)驗(yàn)?zāi)J?,建立了綜合型、設(shè)計(jì)型和開(kāi)放型等多種形式的實(shí)驗(yàn),充分發(fā)揮了實(shí)驗(yàn)教學(xué)培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力和實(shí)踐能力的作用[6-7]。細(xì)胞培養(yǎng)作為醫(yī)學(xué)研究中普遍應(yīng)用的基本技術(shù),目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)本科及研究生的實(shí)驗(yàn)教學(xué),其在一定程度上促進(jìn)了學(xué)生綜合素質(zhì)的培養(yǎng)[8-10]。然而,目前的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)教學(xué)還有許多不足之處。如在實(shí)驗(yàn)方法方面,往往為孤立的實(shí)驗(yàn)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)拼合而成,割裂了一般科學(xué)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程。在實(shí)驗(yàn)內(nèi)容方面,常常注重經(jīng)典,缺乏經(jīng)典與前沿的結(jié)合;注重基礎(chǔ),缺乏基礎(chǔ)與臨床實(shí)踐的結(jié)合;注重傳承,缺乏科研成果的轉(zhuǎn)化教學(xué)。

        干細(xì)胞(Stem Cells,SC)是一類具有自我更新及分化潛能的細(xì)胞,在疾病的細(xì)胞治療和器官移植方面有著巨大的醫(yī)學(xué)應(yīng)用潛力,是世界醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)[11-12]。因其重大的理論意義和無(wú)可估計(jì)的實(shí)際價(jià)值,高校特別是醫(yī)學(xué)院校應(yīng)積極開(kāi)展干細(xì)胞教學(xué)[13]。隨著干細(xì)胞研究熱潮的興起[14],同濟(jì)大學(xué)成立了干細(xì)胞研究中心和臨床轉(zhuǎn)化中心,取得了一些研究成果,特別是在干細(xì)胞的培養(yǎng)及分化方面積累了一些經(jīng)驗(yàn)。

        針對(duì)目前細(xì)胞實(shí)驗(yàn)教學(xué)中存在的問(wèn)題,結(jié)合本校的辦學(xué)定位和專業(yè)特色,我們?cè)O(shè)計(jì)并開(kāi)展了“組織干細(xì)胞的培養(yǎng)及定向分化”的實(shí)驗(yàn)教學(xué),并在醫(yī)學(xué)院5年制和7年制本科生開(kāi)展。該實(shí)驗(yàn)為一個(gè)完整的科學(xué)實(shí)驗(yàn),能使學(xué)生親歷科學(xué)實(shí)驗(yàn)的全過(guò)程,在實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)學(xué)生的科研思維能力和解決問(wèn)題的能力,對(duì)學(xué)生了解科學(xué)發(fā)展動(dòng)態(tài),掌握前沿科學(xué)知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技能具有重要意義。

        1 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的設(shè)計(jì)與實(shí)施

        1.1 組織干細(xì)胞的選擇

        根據(jù)細(xì)胞來(lái)源,干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞和組織干細(xì)胞。雖然胚胎干細(xì)胞具有萬(wàn)能性,能分化為幾乎所以的組織細(xì)胞,但是因其來(lái)源于胚胎,具有倫理問(wèn)題。而組織干細(xì)胞存在于成人各種組織和器官,不存在倫理問(wèn)題。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)是一群來(lái)源于骨髓的組織干細(xì)胞,因其分離方法簡(jiǎn)便,體外可大量擴(kuò)增,細(xì)胞存活率高,便于自體移植及調(diào)控,在特定的誘導(dǎo)條件下可分化為多種細(xì)胞,如骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn),在細(xì)胞治療及組織再生及修復(fù)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[15]。鑒于此,我們選擇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

        在誘導(dǎo)分化方面,考慮脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化時(shí)間短(7~11 d),分化效率高(80% ~90%),容易鑒定(油紅O染色10 min)等優(yōu)點(diǎn)[16-17],所以我們選擇BMSCs誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞并用油紅O染色鑒定。

        1.2 實(shí)驗(yàn)安排及流程

        本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容包括原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、定向分化和脂肪細(xì)胞染色鑒定。為了培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)習(xí)慣和團(tuán)隊(duì)合作精神,實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行(2個(gè)同學(xué)一組),每次實(shí)驗(yàn)完畢后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄,包括細(xì)胞培養(yǎng)記錄和實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄。具體安排如下(見(jiàn)圖1):

        第1次,分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,原代培養(yǎng),37°C培養(yǎng)48 h。

        第2次,觀察細(xì)胞形態(tài)及密度,傳代培養(yǎng),37°C培養(yǎng)4~6 h后,更換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基,37°C繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

        第3次,觀察細(xì)胞形態(tài)、密度及生長(zhǎng)特點(diǎn),換液,37°C培養(yǎng)72 h。

        第4次,油紅O染色鑒定,統(tǒng)計(jì)分化效率。

        圖1 實(shí)驗(yàn)安排及實(shí)驗(yàn)流程

        1.3 實(shí)驗(yàn)考核體系

        實(shí)驗(yàn)考核是教學(xué)過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié),為了取得良好的效果,對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程和結(jié)果進(jìn)行綜合考核并給出合理的成績(jī),是有效地提高教學(xué)質(zhì)量的保證。一種“全過(guò)程-多方式-立體化”的評(píng)價(jià)體系,能確切、客觀、全面地評(píng)定學(xué)生的學(xué)習(xí)能力[18]。因此,我們從以下4個(gè)環(huán)節(jié)全面考核學(xué)生,以達(dá)到促進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果的目的。具體考核內(nèi)容如下:

        (1)動(dòng)手參與程度和團(tuán)隊(duì)合作精神。通過(guò)有效的團(tuán)隊(duì)協(xié)作,培養(yǎng)學(xué)生溝通和交流的能力。

        (2)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和結(jié)果。規(guī)范實(shí)驗(yàn)記錄,設(shè)計(jì)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)記錄表,要求每次觀察細(xì)胞后進(jìn)行拍照,并及時(shí)對(duì)結(jié)果進(jìn)行描述。目的是培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度及數(shù)據(jù)信息的管理能力。

        (3)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)的故障處理。要求以學(xué)生為主體,教師為指導(dǎo)的原則,通過(guò)學(xué)生自主學(xué)習(xí)、自主分析,最終自主解決問(wèn)題。達(dá)到調(diào)動(dòng)學(xué)習(xí)的積極性和主動(dòng)性,形成好的學(xué)習(xí)方法和習(xí)慣,培養(yǎng)其發(fā)現(xiàn)問(wèn)題及解決問(wèn)題的能力。

        (4)實(shí)驗(yàn)報(bào)告完成情況。要求小組撰寫實(shí)驗(yàn)論文,分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以達(dá)到培養(yǎng)學(xué)生分析和整理數(shù)據(jù)的能力。

        2 實(shí)驗(yàn)建設(shè)效果

        2.1 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目安全、穩(wěn)定、可行

        經(jīng)過(guò)嘗試和摸索,建立了以細(xì)胞培養(yǎng)為主線,組織干細(xì)胞培養(yǎng)為特色的綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目,編寫了實(shí)驗(yàn)指導(dǎo),進(jìn)行了相關(guān)的預(yù)實(shí)驗(yàn),并在臨床醫(yī)學(xué)5/7年制本科生中連續(xù)開(kāi)展了3年,每組均可獲得分化的脂肪細(xì)胞(見(jiàn)圖2),效率穩(wěn)定在60% ~80%左右。實(shí)驗(yàn)使用的BMSCs來(lái)源于生物安全級(jí)大鼠,不涉及倫理問(wèn)題,沒(méi)有生物安全隱患。實(shí)驗(yàn)不涉及強(qiáng)腐蝕、毒性試劑和具潛在危險(xiǎn)的儀器。因此,此實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目安全、穩(wěn)定、可行。

        圖2 BMSCs的培養(yǎng)及脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

        2.2 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目為綜合型實(shí)驗(yàn)

        以往的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)往往為孤立的實(shí)驗(yàn)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)的拼合,缺乏系統(tǒng)性、連續(xù)性和完整性,不能真實(shí)地體現(xiàn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程。為了培養(yǎng)學(xué)生的科研能力,適應(yīng)當(dāng)代醫(yī)學(xué)生的培養(yǎng)目標(biāo),我們?cè)O(shè)計(jì)了此綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目,具有系統(tǒng)性、連續(xù)性和完整性。

        實(shí)驗(yàn)是以細(xì)胞培養(yǎng)為中心的綜合實(shí)驗(yàn),涉及組織干細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng),細(xì)胞傳代培養(yǎng),干細(xì)胞的分化和組織化學(xué)檢測(cè)4項(xiàng)基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)及分子生物學(xué)、生物化學(xué)、組織化學(xué)等方面的理論知識(shí)。采用原代培養(yǎng)—傳代培養(yǎng)—定向分化—細(xì)胞鑒定4個(gè)連續(xù)的實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)過(guò)程與實(shí)際的科學(xué)研究一致,為一個(gè)完整的科學(xué)實(shí)驗(yàn)過(guò)程,具有系統(tǒng)性、連續(xù)性和完整性。由于4個(gè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容環(huán)環(huán)相扣,需要學(xué)生認(rèn)真地完成每一個(gè)實(shí)驗(yàn),直至獲得最終的結(jié)果,因此增加了學(xué)生的動(dòng)腦、動(dòng)手機(jī)會(huì),有利于培養(yǎng)學(xué)生的科研思維能力及基本實(shí)驗(yàn)技能,為學(xué)生的科研能力的培養(yǎng)打下較為堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

        2.3 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目體現(xiàn)了經(jīng)典與前沿的結(jié)合

        以前的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)常常是用傳統(tǒng)的細(xì)胞系進(jìn)行的,如Hela或293細(xì)胞,未能與科學(xué)發(fā)展的前沿結(jié)合,不利于學(xué)生掌握先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)知識(shí)和技能。

        建設(shè)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目是進(jìn)行組織干細(xì)胞的培養(yǎng)、分化和鑒定,而干細(xì)胞因其重大的理論意義和無(wú)可估計(jì)的實(shí)際價(jià)值,目前成為世界科學(xué)界研究的熱點(diǎn),因此,本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目在最經(jīng)典的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,結(jié)合前沿理論知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技能,既傳承了經(jīng)典,又跟上時(shí)代的發(fā)展,與培養(yǎng)新時(shí)期高素質(zhì)和創(chuàng)新人才的需要相一致。對(duì)于學(xué)生了解科學(xué)發(fā)展的動(dòng)態(tài),掌握前沿科學(xué)知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技能具有重要意義。

        2.4 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目體現(xiàn)了科研成果的轉(zhuǎn)化教學(xué)

        組織干細(xì)胞因其具有多分化潛能,在創(chuàng)傷修復(fù)、細(xì)胞替代治療、基因治療等方面具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景,是目前世界性課題,也是項(xiàng)目所在的教學(xué)團(tuán)隊(duì)主要從事研究的課題之一。其中,骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化為脂肪細(xì)胞的研究取得了較好的研究成果,分化的脂肪細(xì)胞成熟度高、重現(xiàn)性好、難易程度適中,適合轉(zhuǎn)化為實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目[19]。實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目在教學(xué)中的順利實(shí)施證明了科研成果的轉(zhuǎn)化可使實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容緊跟學(xué)科技術(shù)的發(fā)展,充分體現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)教學(xué)是實(shí)現(xiàn)科研成果向教學(xué)內(nèi)容轉(zhuǎn)化的主要途徑[19-20]。

        3 結(jié)語(yǔ)

        細(xì)胞培養(yǎng)為具有百年歷史的經(jīng)典細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),在醫(yī)學(xué)教育中具有重要的作用。而干細(xì)胞具有十分誘人的臨床應(yīng)用前景,是當(dāng)今世界研究的熱點(diǎn)。因此,干細(xì)胞的培養(yǎng)、分離、分化和鑒定是當(dāng)代醫(yī)學(xué)生應(yīng)該了解和掌握的實(shí)驗(yàn)技能。

        實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目在經(jīng)典的細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上,結(jié)合前沿理論知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技能,既使學(xué)生掌握了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技能,又使學(xué)生了解學(xué)科發(fā)展的方向,使學(xué)生跟上時(shí)代的發(fā)展,體現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的前沿性與前瞻性,這與培養(yǎng)新時(shí)期高素質(zhì)和創(chuàng)新人才的需要相一致。

        [1] 美國(guó)中華醫(yī)學(xué)基金會(huì).全球醫(yī)學(xué)教育最基本要求[J].醫(yī)學(xué)教育,2002(4):23-25.

        [2] 史寧中,柳海民.素質(zhì)教育的根本目的與實(shí)施路徑[J].教育研究,2007(8):10-14.

        [3] 倪 虹,秦君芳.對(duì)“卓越醫(yī)師教育培養(yǎng)計(jì)劃”建設(shè)中培養(yǎng)起點(diǎn)的思考[J].衛(wèi)生職業(yè)教育,2013,31(6):5-7.

        [4] 榮 昶,趙向陽(yáng),蔡慧萍.實(shí)驗(yàn)教學(xué)與創(chuàng)新能力培養(yǎng)探析[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索,2004,23(1):12-13.

        [5] 孫文彬.開(kāi)放性創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革與實(shí)踐[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索,2006,25(2):148-151.

        [6] 張學(xué)軍,王鎖萍.全面改革實(shí)驗(yàn)教學(xué) 培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索,2005,24(1):4-6.

        [7] 鄭家茂.對(duì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)若干問(wèn)題的厘析[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索,2007,26(10):1-5.

        [8] 閆曉梅,王蓮蕓,秦敏君.細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染技術(shù)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)和探討[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索,2012,31(11):103-107.

        [9] 何志穎,訾曉淵,朱海英,等.醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)教學(xué)的設(shè)計(jì)與實(shí)施[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào):基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育版,2010,12(11):1088-1090.

        [10] 余 瑾,張 藝,楊 勁.八年制細(xì)胞生物學(xué)設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)教學(xué)實(shí)踐[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育,2012,14(1):41-42.

        [11] 周 林.干細(xì)胞研究進(jìn)展及意義[J].世界科技研究與發(fā)展,2001,23(6):39-42.

        [12] Zhu H H,Huang X J.Current status of stem cell therapy in China[J].Int J Hematol Oncol,2013,2(4):289-297.

        [13] Salli U,Long S W,Carlsen W S,et al.Stem cell biology should be taught in high schools[J].CBE Life Sci Educ,2007,6(4):283-284.

        [14] Yuan W,Sipp D,Wang Z Z,et al.Stem Cell Science On the Rise in China[J].Cell Stem Cell,2012,10(1):12-15.

        [15] 李 陳,肖玉周.不同來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性差異研究進(jìn)展[J].創(chuàng)傷外科雜志,2014,16(1):75-78.

        [16] 徐小雅,金慰芳,王洪復(fù).大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2007,34(1):141-143.

        [17] 賈秀娟,孫曉娟,徐麗麗.特定微環(huán)境條件下人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2008,12(34):6635-6638.

        [18] 陳 森,張師平,吳 平.基于課題型的研究性實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式探索與實(shí)踐[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索,2013,32(7):171-174.

        [19] 周權(quán)鎖,馬宗駿,高彥征,等.科研內(nèi)容和成果向?qū)I(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目的轉(zhuǎn)化[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)教育,2009(5):59-61.

        [20] 王廣彥.科研成果向教學(xué)內(nèi)容的轉(zhuǎn)化研究[J].理工高教研究,2009,28(4):120-123.

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