楊佳等

摘要：發(fā)菜是一種具有豐富膠質(zhì)鞘、色素、多糖的陸生藍(lán)藻。采用Omega RNA提取試劑盒、Trizol RNA提取法、天根試劑盒及優(yōu)化后的Omega RNA提取試劑盒、Trizol法、天根試劑盒法從發(fā)菜藻體中提取RNA，并用核酸濃度測(cè)定儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的總RNA質(zhì)量。結(jié)果表明，優(yōu)化前后的Trizol法均無(wú)法提取到發(fā)菜總RNA；利用Omega試劑盒獲得發(fā)菜總RNA已降解；利用天根試劑盒可獲得發(fā)菜總RNA，進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化天根試劑盒的提取程序，獲得的發(fā)菜總RNA 23S、16S條帶清晰，D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm分別為2.06、2.08。研究結(jié)果為深入開(kāi)展發(fā)菜轉(zhuǎn)錄組研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：發(fā)菜；總RNA；提??；方法優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)：Q781文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0058-03

收稿日期：2014-08-22

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31360054）。

簡(jiǎn)介作者：楊佳（1988—），女，山東菏澤人，碩士研究生，主要從事資源植物學(xué)方面的研究。E-mail：yangjia713@126.com。

通信作者：梁文裕，博士，教授，主要從事植物資源及植物分子生物學(xué)的研究。E-mail：liangwy2009@163.com。生物體性狀和對(duì)外界環(huán)境的響應(yīng)歸根到底是由基因調(diào)控的，基因調(diào)控主要涉及到核酸、蛋白質(zhì)等生物分子，高質(zhì)量RNA是進(jìn)行基因表達(dá)分析的基礎(chǔ)。細(xì)胞內(nèi)RNA分子多樣性和易被降解的特性決定了RNA提取過(guò)程的復(fù)雜性[1]，RNA酶高穩(wěn)定性是造成RNA分離困難的主要原因。RNA提取過(guò)程中出現(xiàn)的RNA酶有2種來(lái)源：外源性RNA酶和內(nèi)源性RNA酶。外源RNA來(lái)自RNA制備過(guò)程中用到的玻璃和塑料制品、研究人員本身以及分離過(guò)程中用到的試劑或溶液，但這些外源性RNA酶可以通過(guò)RNA酶抑制劑處理或使用RNA研究的專(zhuān)用試劑等措施來(lái)解決[2-4]。而內(nèi)源性RNA酶存在于材料本身，如材料的不新鮮會(huì)降低RNA的產(chǎn)量，破碎細(xì)胞內(nèi)含物常與RNA形成難溶的物質(zhì)（多糖類(lèi)等）導(dǎo)致RNA分離困難[5-6]，因此，諸多因素會(huì)直接影響RNA的提取效果，增加RNA的提取難度。

發(fā)菜（Nostoc flagelliforme）是一種陸生固氮藍(lán)藻，生長(zhǎng)在干旱-半干旱荒漠草原地區(qū)，具有獨(dú)特的抗干旱、高溫、高光照度、紫外線(xiàn)等非生物脅迫的特性[7]。RNA提取是探索發(fā)菜抗逆差異基因表達(dá)或轉(zhuǎn)錄組研究的重要基礎(chǔ)，但由于發(fā)菜藻體被較厚的膠質(zhì)鞘包被，對(duì)發(fā)菜藻體和細(xì)胞的破碎存在一定難度，同時(shí)發(fā)菜藻體富含的多糖、色素、蛋白質(zhì)等會(huì)以不同方式干擾RNA的提取，從而加大了發(fā)菜藻體RNA提取的難度。目前，國(guó)內(nèi)尚無(wú)發(fā)菜高質(zhì)量RNA提取的相關(guān)報(bào)道，找到適合提取發(fā)菜總RNA的方法具有重要意義。本研究對(duì)3種發(fā)菜藻體RNA的提取方法進(jìn)行比較和優(yōu)化，篩選出最適合發(fā)菜RNA的提取方法，為從抗逆差異基因表達(dá)或轉(zhuǎn)錄組角度研究發(fā)菜耐干旱、抗紫外輻射等機(jī)理奠定重要基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

野生新鮮發(fā)菜采自寧夏賀蘭山發(fā)菜自然生長(zhǎng)地。

1.2發(fā)菜藻體總RNA的提取及優(yōu)化

1.2.1Omega試劑盒法提取發(fā)菜藻體總RNA將研磨充分的發(fā)菜藻體粉末轉(zhuǎn)入Buffer RCL中（含β-巰基乙醇），迅速渦旋振蕩，使材料充分裂解，按Omega公司E.Z.N.A.TM Plant RNA Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)中的E.Z.N.A.TM Plant RNA Protocol Ⅱ進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2Trizol法提取發(fā)菜藻體總RNA按照TRIzol Reagent說(shuō)明書(shū)進(jìn)行發(fā)菜藻體RNA的提取。

1.2.3天根試劑盒法提取發(fā)菜RNA將充分研磨至粉末的發(fā)菜藻體迅速轉(zhuǎn)移至裂解液SL（含β-巰基乙醇）中，立即渦旋劇烈振蕩混勻，按天根公司RNAprep Pure Plant Kit試劑盒步驟提取發(fā)菜藻體總RNA。

1.3發(fā)菜藻體總RNA提取方法的優(yōu)化

1.3.1Omega試劑盒方法的優(yōu)化參照Omega試劑盒法稍作修改。使用700 μL Buffer RCL進(jìn)行材料的裂解。試驗(yàn)步驟中增加DNase I，即當(dāng)RNA全部吸附到HiBindTM RNA Mini柱子上后，加300 μL RWC Wash Buffer到柱子上，10 000 g離心1 min，把配好的DNase Ⅰ mix準(zhǔn)確地加入柱子中心，室溫靜置15 min；將HiBindTM RNA Mini柱子放入1個(gè)新的收集管中，加400 μL RWC Wash Buffer，靜置5 min，10 000 g離心 1 min；最后加入在70 ℃水中孵育的DEPC水進(jìn)行RNA的提取。

1.3.2改良Trizol法提取發(fā)菜RNA對(duì)TRIzol Reagent RNA的提取方法稍作修改。向研磨好的發(fā)菜細(xì)胞中加入1 mL Trizol 后，用渦旋混合器充分混勻，并在冰上放置15 min；55～60 ℃水孵育10～15 min后，4 ℃放置1 h再轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱備用。

1.3.3天根試劑盒方法的優(yōu)化參照天根試劑盒法稍作修改。將研磨好的材料加入裂解液SL充分渦旋振蕩混勻后，12 000 g 離心3 min；2次加入去蛋白液RW1后，放置1 min再進(jìn)行離心1 min；用漂洗液RW漂洗3次再空轉(zhuǎn)離心2 min；加入RNase-Free水后于室溫放置5 min后離心收集RNA。

1.4RNA質(zhì)量和完整性檢測(cè)

1.4.1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分別取RNA樣品進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠，電泳條件為0.5×TAE緩沖液、160 V恒壓、15 min，紫外燈下觀(guān)察RNA條帶并照相記錄結(jié)果。

1.4.2RNA產(chǎn)量和純度檢測(cè)RNA產(chǎn)量和純度通過(guò)核酸濃度測(cè)定儀進(jìn)行檢測(cè)。通常D260 nm/D280 nm比值在1.8～2.2之間，D260 nm/D230 nm比值在2.0左右，說(shuō)明RNA純度較高，D260 nm/D280 nm比值為2.0時(shí)質(zhì)量最高[8]。用RNase free ddH2O作為空白對(duì)照，取1 μL RNA樣品，用核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm以及RNA的濃度（ng/μL）值。

2結(jié)果與分析

2.13種方法提取發(fā)菜總RNA質(zhì)量比較

Omega試劑盒法提取的發(fā)菜總RNA樣品電泳顯示無(wú)典型的RNA條帶（圖1）；Trizol法所提RNA無(wú)23S、16S條帶，只有1條條帶，表明RNA完全降解（圖2）；天根試劑盒法提取的發(fā)菜總RNA電泳結(jié)果表明，23S、16S條帶明顯，但條帶拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重（圖3）。

用核酸濃度測(cè)定儀分別檢測(cè)3種方法所提發(fā)菜藻體RNA的產(chǎn)量和純度，檢測(cè)結(jié)果表明，Omega試劑盒所測(cè)值均超出了正常值的范圍；Trizol法所提RNA相關(guān)數(shù)據(jù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常值范圍，RNA濃度值較高，說(shuō)明所提RNA不純，蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)污染嚴(yán)重；天根試劑盒法所得數(shù)值均正常，且D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm比值接近2.0，說(shuō)明RNA純度較高，可進(jìn)行優(yōu)化后用于后續(xù)的分子試驗(yàn)（表1）。

2.23種方法優(yōu)化后所提發(fā)菜藻體RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

優(yōu)化后Omega試劑盒法所提發(fā)菜總RNA（圖4）與優(yōu)化表1不同方法所提發(fā)菜藻體RNA的質(zhì)量及產(chǎn)量檢測(cè)

方法D260 nm/D280 nmD260 nm/D230 nmRNA濃度

（ng/μL）峰值波長(zhǎng)

（nm）Omega試劑盒法2.122.47737.7260Trizol法1.720.53328.3220天根試劑盒法2.071.9397.1260

前（圖1）無(wú)明顯差異，用DNase處理后，仍有雜帶，無(wú)明顯改變，在最下1條亮帶以上，能清晰看到4條條帶，這與正常RNA電泳條帶相異，推測(cè)Omega試劑盒不適合發(fā)菜藻體RNA的提?。桓牧己蟮腡rizol法23S、16S 2條帶已有大部分降解，5S條帶比較明亮，并伴有拖尾現(xiàn)象，表明該方法所提RNA降解快，不適合進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)（圖5）；優(yōu)化后的天根試劑盒法所提發(fā)菜總RNA質(zhì)量有明顯提高，23S、16S條帶清晰，無(wú)明顯彌散、拖尾現(xiàn)象（圖6）。

與沒(méi)有優(yōu)化前的3種RNA提取方法相比，優(yōu)化的Omega試劑盒法和改良Trizol法所提RNA并沒(méi)有提高其質(zhì)量和純度，優(yōu)化的Omega試劑盒法比值依然較高；改良Trizol法所得比值均低，說(shuō)明改良后Trizol法所提RNA仍伴有蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)的污染；天根試劑盒經(jīng)過(guò)優(yōu)化，所提取的RNA質(zhì)量和濃度都有所增加，D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm、濃度分別達(dá)2.06、2.08、154.3 ng/μL（表2），260 nm處峰值顯著（圖7）。

表2不同方法優(yōu)化后所提發(fā)菜藻體RNA的質(zhì)量及產(chǎn)量檢測(cè)

方法D260 nm/

D280 nmD260 nm/

D230 nmC

（ng/μL）峰值波長(zhǎng)

（nm）優(yōu)化Omega試劑盒法2.122.24663.1260改良Trizol法1.770.5845.5220優(yōu)化天根試劑盒法2.062.08154.3260

3討論

RNA提取一般采用研磨等方法使細(xì)胞破碎，通過(guò)去除材料中的多糖、蛋白質(zhì)、DNA的污染，進(jìn)一步進(jìn)行洗滌和沉淀，最終得到純度較高的RNA。有效細(xì)胞裂解是提取高質(zhì)量及高產(chǎn)量RNA的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8-9]，由于發(fā)菜藻體富含膠質(zhì)、色素和多糖等，并且極易大量吸水和細(xì)胞壁堅(jiān)硬的特性造成了RNA提取困難，對(duì)發(fā)菜藻體和細(xì)胞破碎以及緩沖液的選擇無(wú)疑成為提取其RNA的關(guān)鍵步驟。筆者進(jìn)行了幾種破碎方法的比較，發(fā)現(xiàn)采用反復(fù)多次液氮研磨是破碎發(fā)菜藻體和細(xì)胞的理想方法。然而研磨過(guò)程中還應(yīng)確保研磨用力恰當(dāng)、液氮充足，避免材料溶解，而且研磨時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)（小于8 min）。

根據(jù)不同試驗(yàn)?zāi)康暮筒牧?，RNA提取可采用不同的方法[10-11]。李亞軍等研究表明，Trizol法能更簡(jiǎn)單有效獲得萊茵衣藻中高質(zhì)量的RNA，而最適合提取微芒藻中高質(zhì)量RNA的方法是SDS-LiCl沉淀法[12]。本研究結(jié)果表明，Omega試劑盒法所提取的RNA伴隨雜質(zhì)較多；Trizol法和改良Trizol法均不適用于發(fā)菜藻體RNA的提取，D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm 都與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值相差甚遠(yuǎn)；天根試劑盒法是發(fā)菜總RNA提取的理想選擇，所得發(fā)菜RNA基本可以滿(mǎn)足RT-PCR要求，但仍達(dá)不到轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的要求。通常情況下，試劑盒法所提取的RNA質(zhì)量并不高，原因是不同材料組織結(jié)構(gòu)以及其中所含物質(zhì)的種類(lèi)不同，導(dǎo)致試劑盒在提取過(guò)程中并不理想，因此，試劑盒使用應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康募霸囼?yàn)材料的特性進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。王友華等用改進(jìn)的熱酚提取法獲得了高質(zhì)量的棉花根總RNA[13]；王春暉等通過(guò)對(duì)2種試劑盒法和改良的異硫氰酸胍法的比較，得出改良的異硫氰酸胍法所提出的棉花幼根總RNA能夠滿(mǎn)足轉(zhuǎn)錄組測(cè)序要求[14]；楊曉燕等針對(duì)3種常用RNA提取試劑盒對(duì)紅地球葡萄葉樣品RNA的提取效果進(jìn)行評(píng)估和優(yōu)化，結(jié)果顯示最適于提取葡萄葉片總RNA的為RNeasy Plant Mini Kit試劑盒，同樣需要延長(zhǎng)提取試劑與樣品的接觸時(shí)間從而提高RNA的提取質(zhì)量[8]。筆者對(duì)Omega RNA提取試劑盒、Trizol RNA提取法、天根試劑盒等3種方法進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，天根試劑盒法所提發(fā)菜RNA質(zhì)量最高，達(dá)到轉(zhuǎn)錄組測(cè)序要求。