陳樹越，徐楊，潘艷，羅明志，曾慧龍,鄧林紅△

(1.常州大學(xué) 信息科學(xué)與工程學(xué)院，常州 213164) (2.常州大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程與健康科學(xué)研究院，常州市呼吸醫(yī)學(xué)工程重點實驗室，江蘇 常州 213164)

1 引 言

肌動蛋白聚合形成的微絲纖維，有時也稱為應(yīng)力纖維，是成纖維細胞和平滑肌細胞等間充質(zhì)細胞的細胞骨架的重要組成部分，對細胞變性、組織缺損以及創(chuàng)傷修復(fù)等具有十分重要的作用[1-3]。因此，對細胞內(nèi)微絲纖維的形態(tài)學(xué)進行定量化的表征和分析在研究這類細胞的物理行為中具有重要意義。

目前，研究者們對成纖維細胞等的生物學(xué)行為及其在組織創(chuàng)傷修復(fù)等臨床應(yīng)用方面進行了大量的研究工作。例如Kim等做了關(guān)于脂肪來源的干細胞(ADSC)是否對人類皮膚成纖維細胞分泌影響的研究，通過實驗證明了ADSC能夠促進成纖維細胞分泌，適合運用于皮膚的創(chuàng)傷恢復(fù)[4]。邢幫榮等進行了表皮生長因子與堿性成纖維細胞生長因子促進創(chuàng)面修復(fù)的比較研究，發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)面修復(fù)中、晚期使用堿性成纖維細胞生長因子能夠促進創(chuàng)面的再上皮化[5]。相對而言，對細胞內(nèi)微絲纖維形態(tài)的定量化研究近年來才越來越受到研究者們的重視。例如Comin等人提出了一套針對肌纖維的細胞圖像特征分析方法，其中不僅對細胞內(nèi)微絲纖維進行了特征提取，并且對提取出的特征進行了長度等特征量的定量分析和對方法準(zhǔn)確度進行了數(shù)據(jù)分析[6]。

本研究利用激光掃描共聚焦顯微鏡對大鼠氣道平滑肌細胞的微絲纖維結(jié)構(gòu)進行了觀察和顯微拍照，通過形態(tài)學(xué)與閾值處理相結(jié)合的方式對指定細胞切面的微絲纖維進行了形狀特征提取，并從形狀特征的角度選定適合的形狀特征量對微絲纖維進行了定量分析。這些研究可望為定量表征和分析細胞的物理行為，如變形和遷移運動等提供新方法。

2 激光掃描共聚焦顯微鏡及大鼠氣道平滑肌細胞的微絲結(jié)構(gòu)特點

2.1 激光掃描共聚焦顯微成像的原理

激光掃描共聚焦顯微成像(LSCM)[7-8]是近代最先進的細胞生物醫(yī)學(xué)分析手段之一，已經(jīng)廣泛地運用于生物醫(yī)學(xué)的研究中[9]，它除了光學(xué)顯微鏡部分外，還由激光發(fā)射器、掃描裝置、計算機系統(tǒng)、光檢測器以及圖像傳輸?shù)任宀糠纸M成。

與傳統(tǒng)的顯微成像方法相比，激光掃描共聚焦顯微成像通過只檢測反射自焦平面的光線部分從而防止由于焦平面上下散射光線對圖像的影響，明顯提高了圖像的分辨率和對比度，并且通過精細地平面光切，經(jīng)過計算機三維重建之后，可以從任意角度對實驗樣本進行三維剖面以及整體結(jié)構(gòu)的觀察分析。

2.2 實驗材料

(a)

(b)

Fig1Representativemicroscopicimagesofthemicrofilamentsinairwaysmoothmusclecellsoriginal image of cell I (a) and cell II (b)

3 大鼠氣道平滑肌細胞微絲纖維的結(jié)構(gòu)特征分析

3.1 細胞微絲纖維結(jié)構(gòu)提取

為了能夠?qū)毎⒔z結(jié)構(gòu)進行有效提取，我們利用形態(tài)學(xué)與閾值分割相結(jié)合的方式對圖1所示的細胞顯微圖像進行處理，其流程見圖2。首先，利用33的中值濾波對圖像中存在的大顆粒椒鹽噪聲進行有效地濾除，并利用截止頻率為10的巴特沃斯濾波器對圖像進行銳化處理，再結(jié)合數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)，以半徑為1的圓盤矩陣對圖像進行開運算處理，濾除小顆粒的椒鹽噪聲，最后通過全局閾值分割提取微絲纖維結(jié)構(gòu)并將其骨骼化。

巴特沃斯高通濾波器通過控制截止頻率D0，可以獲得不同的銳化效果，n階截止頻率為D0的巴特沃斯高通濾波器的轉(zhuǎn)移函數(shù)可表示為[10]:

圖2 提取細胞微絲纖維結(jié)構(gòu)的流程圖

(1)

其中D(i,j)為點(i,j)到頻率平面原點的距離。

設(shè)B為結(jié)構(gòu)元素，集合A為待處理的圖像，利用結(jié)構(gòu)元素B對A進行開運算可記為:

A·B=(AΘB)?B

(2)

其中，A·B可以看成是B在A內(nèi)平移后的并集，通過B對A進行腐蝕，再利用B對A進行膨脹，能夠除去掉A中不能包含結(jié)構(gòu)元素B的對象區(qū)域，并且斷開狹窄的連接，去除細小的突出部分。利用上述方法處理圖2中的細胞顯微圖像，提取得到大鼠氣道平滑肌細胞微絲纖維結(jié)構(gòu)的結(jié)果見圖3。從中可見細胞的微絲纖維主干較好地被分割出來，并且骨骼化后的效果也較好，提高了特征分析的準(zhǔn)確性。

圖3經(jīng)過圖像處理提取得到的氣道平滑肌細胞微絲纖維結(jié)構(gòu)

a、b：細胞I、II的微絲纖維二值圖像，c、d：細胞I、II的微絲纖維結(jié)構(gòu)骨骼化后的骨架形態(tài)

Fig3Theintracellularstructureofmicrofilamentsofairwaysmoothmusclecellsextractedviaimageprocessing.

a, b：The binary images of cell I and II, respectively. c, d：The skeleton image of the microfilaments in cell I and II, respectively

3.2 大鼠氣道平滑肌細胞微絲纖維形狀的特征分析

形狀特征即為物體表現(xiàn)出來的視覺特征，其具有直觀性和易理解性的特點。形狀特征一般可以分為兩類[11]，一類是基于邊界的特征，一類則是基于區(qū)域的特征。

(1)微絲纖維幾何特征分析

隨著城鎮(zhèn)經(jīng)濟社會發(fā)展，京津冀、長三角和珠三角城市群的居民生活用電量逐漸上升，用電量差距越來越大。京津冀、長三角和珠三角城市群的居民生活用電量及變化率見圖1。

我們采用了邊界和區(qū)域特征結(jié)合的方法描述大鼠氣道平滑肌細胞微絲纖維的形狀特征，包括微絲纖維數(shù)量、長度、寬度3個幾何形狀因子，并以此作為描述依據(jù)，對小鼠平滑肌細胞微絲纖維結(jié)構(gòu)進行了定量分析。

微絲纖維數(shù)量N作為常見的區(qū)域形狀特征描述因子，基于標(biāo)記圖像中連通域的思想[12]，通過對提取出的細胞微絲纖維骨架進行標(biāo)記，實現(xiàn)微絲纖維數(shù)量的統(tǒng)計。該方法不僅能夠有效地對微絲纖維進行統(tǒng)計標(biāo)記，而且計算簡單，運算速度快。

當(dāng)細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的時候，微絲纖維的長度、寬度也會隨之發(fā)生變化。設(shè)微絲長度為L，微絲寬度為W。對骨骼化后的微絲纖維進行各個連通域內(nèi)的像素數(shù)Ni的統(tǒng)計，可以計算出各微絲纖維的長度，即：

Li=Ni，i∈(1，N)

(3)

微絲纖維寬度可以采用微絲纖維面積Si與長度Li的比值表達，即：

(4)

通過統(tǒng)計各個微絲纖維的長度Li、寬度Wi，可以計算出細胞內(nèi)微絲纖維的平均長度和寬度。

(2)微絲纖維分布特征分析

微絲纖維的區(qū)域分布是細胞后續(xù)行為功能的重要參數(shù)，利用灰度共生矩陣分析其灰度的空間分布來描述微絲纖維的區(qū)域分布特征，選擇能量、熵、逆差距三個參數(shù)作為描述因子反映區(qū)域變化。

設(shè)f(x,y)為圖像中的一個點,f1(x1,y1)為偏離它的一點，設(shè)該點對的灰度范圍為(g1,g2)，令f(x,y)遍歷整個圖像，則會得到一組(g1,g2)值，設(shè)其灰度值級為k，則(g1,g2)可能存在k的平方種，統(tǒng)計在各個灰度級上出現(xiàn)的次數(shù)，得出一個矩陣，并根據(jù)各級(g1,g2)出現(xiàn)的次數(shù)計算出概率p(g1,g2)，這種矩陣即為灰度共生矩陣。

設(shè)E為角度方向二階矩陣即能量，其體現(xiàn)圖像的灰度分布均勻程度和規(guī)則變化程度，E值越大則說明紋理分布不均勻，集中在某一塊，紋理呈規(guī)則性變化，E越小則表明紋理分布均勻。E可表達為[13]：

(5)

設(shè)H為熵值，其體現(xiàn)圖像紋理分布的離散程度，H越大則表明其灰度空間分布越分散，H越小則表明其灰度空間分布越集中。H可表達為[13]：

(6)

設(shè)I為逆差距，其體現(xiàn)圖像紋理的局部變化程度，I越大表明圖像紋理局部均勻，反之I越小表明圖像紋理局部不均勻。I可表達為[13]：

(7)

4 實驗結(jié)果與分析

4.1 微絲纖維幾何特征實驗分析

本次實驗分別從兩組細胞切片組中隨機選取兩張切片圖像(見圖1 細胞I、II)，按以上所述方法對細胞內(nèi)微絲纖維數(shù)量、長度、寬度進行統(tǒng)計分析。

圖4為選定的兩個細胞切片中序號為1～32的微絲纖維的長度統(tǒng)計結(jié)果。從圖中可清晰地看出細胞內(nèi)微絲纖維的長度分布。細胞I的微絲纖維長度整體大于細胞II的微絲纖維長度，長度分布于15.53～174.87μm之間，其中最長的微絲長約174.87μm，貫穿整個細胞切面，其平均微絲纖維長度為41.63μm；細胞II的微絲纖維長度分布于6.83～92.25μm之間，其中最長的微絲纖維長度約92.25μm，平均微絲纖維長度為26.32μm。

圖5為這兩個細胞切面圖像中微絲纖維的寬度統(tǒng)計結(jié)果?？梢娂毎鸌和細胞II中微絲纖維的寬度整體上相近。細胞I的微絲纖維寬度分布于0.03～0.18μm之間,平均寬度為0.08μm；細胞II的微絲纖維寬度分布于0.01～0.47μm之間，平均寬度為0.09μm。

表1為上述二個典型的細胞切片中微絲纖維的幾何形態(tài)統(tǒng)計結(jié)果的特征值與樣品實際參考值(括號中為計算值與實際值之間的相對誤差)，包括微絲纖維的數(shù)量、平均長度、平均寬度。從表中數(shù)據(jù)可以看出，計算值與實際參考值相近，誤差較低，能夠較為有效地對大鼠氣道平滑肌細胞中微絲纖維進行數(shù)量、長度等幾何特征統(tǒng)計。

表1大鼠氣道平滑肌細胞中微絲纖維的幾何特征實際值與計算值

Table1Actualvaluesandstatisticalvaluesofshapeandorientationofmicrofilamentsinairwaysmoothmusclecells

樣品名稱數(shù)量平均長度(μm) 平均寬度(μm)實際參考值細胞I3238.060.09細胞II3224.780.11本文計算值細胞I3241.63(9.37%)0.08(11.11%)細胞II3226.32(6.21%)0.09(18.18%)

圖4大鼠氣道平滑肌細胞微絲纖維長度統(tǒng)計結(jié)果
細胞I(左)和細胞II(右)的微絲纖維長度分布
Fig4Thestatisticalresultsoflengthdistributionofthemicrofilaments.
The length distribution of microfilaments in cell I (left panel) and cell II (right panel)

圖5 大鼠氣道平滑肌細胞微絲寬度統(tǒng)計結(jié)果細胞I(左)和細胞II(右)的微絲纖維寬度分布Fig 5 The statistical results of microfilaments in airway smooth muscle cells.The width distribution of microfilaments in cell I (left panel) and cell II (right panel)

4.2 微絲纖維分布特征實驗分析

利用灰度形態(tài)學(xué)對圖1中兩組細胞圖像分別作微小膨脹和微小腐蝕，仿真細胞微絲的生理、病理或應(yīng)力響應(yīng)的變化狀態(tài)，并利用灰度共生矩陣進行分析這種變化。

圖6為兩組細胞的生理、病理或應(yīng)力響應(yīng)的變化仿真圖像，對細胞I微絲二值圖像進行微小膨脹，對細胞II微絲二值圖像進行微小腐蝕。

圖6大鼠氣道平滑肌細胞微絲纖維生理、病理或應(yīng)力響應(yīng)的變化仿真圖像
細胞I(左)做膨脹處理和細胞II(右)做腐蝕處理

Fig6Physiological,pathologicalorstressresponsechangingsimulationimageofthemicrofilamentsinairwaysmoothmusclecells
Expansion treatment in cell I (left panel) and Corrosion treatment in cell II (right panel)

表2為兩組細胞纖維生理、病理或應(yīng)力響應(yīng)的變化仿真前后，灰度共生矩陣參數(shù)變化(括號中為各參數(shù)變化大小)，從表中數(shù)據(jù)可以看出在模擬細胞行為變化前后，能量和熵值會根據(jù)仿真行為的變化而出現(xiàn)較為顯著的變化，尤其是熵的相對變化分別達到了29.60%和37.11%。而逆差距則無明顯變化。在對細胞I微絲做膨脹模擬實驗時，會出現(xiàn)能量明顯降低而熵值明顯增大情況，分別改變了-7.06%和+29.60%；在對細胞II微絲做收縮模擬實驗時，會出現(xiàn)能量明顯增大而熵值明顯降低情況，分別改變了+7.85%和-37.11%。

表2大鼠氣道平滑肌細胞中微絲纖維生理、病理或應(yīng)力響應(yīng)的變化仿真前后灰度共生矩陣參數(shù)值

Table2GLCMvaluesofmicrofilamentsinairwaysmoothmusclecellswithchangesinphysiological,pathological,orstressresponse

樣品名稱仿真操作能量逆差距 熵細胞I0.8210.9840.402膨脹操作0.763(-7.06%)0.985(+1.02%)0.521(+29.60%)細胞II0.8280.9840.388腐蝕操作0.893(+7.85%)0.985(+1.02%)0.244(-37.11%)

5 結(jié)論

通過形態(tài)學(xué)結(jié)合閾值分割對大鼠氣道平滑肌細胞內(nèi)部微絲纖維的主干進行有效提取，并從形狀特征的角度，以數(shù)量、長度、寬度三個特征量對細胞切面進行了形狀特征的定量分析，從分析結(jié)果可以看出，所給出的方法能夠較為精確地計算出細胞內(nèi)部微絲長度、寬度等幾何特征量，測量結(jié)果與實際結(jié)果相近，且利用幾何形態(tài)學(xué)對圖像進行微腐蝕和微膨脹的操作來進行纖維生理、病理或應(yīng)力響應(yīng)的變化仿真實驗。通過灰度共生矩陣計算仿真前后變化發(fā)現(xiàn)，在模擬微絲膨脹和收縮行為時，能量和熵會發(fā)生明顯變化。形態(tài)特征作為幾何特征可以直觀描述細胞內(nèi)部微絲纖維的形態(tài)變化，且結(jié)合紋理特征能夠作為纖維生理、病理或應(yīng)力響應(yīng)的區(qū)域特征變化依據(jù)，在細胞指定切面分析這種變化，有利于研究者們從二維平面的角度對細胞進行全面分析。