范春光，孫立魁，劉增祥，劉成虎，李春令，侯麗

(山東省醫(yī)療器械產品質量檢驗中心; 山東省醫(yī)療器械生物學評價重點實驗室，山東 濟南 250101)

1 引 言

熱原檢測是醫(yī)療器械生物學評價中的重要項目。目前，醫(yī)療器械熱原檢測試驗有兩種：細菌內毒素檢測法(鱟試劑法)和兔法。2009年，歐洲藥典收錄了體外熱原檢查法，美國FDA也接受了5種基于人免疫細胞的注射用藥熱原體外試驗法[1]。研究[2]表明，人全血IL-1β ELISA試驗是較為理想的體外檢測法。但是，此方法并未在醫(yī)療器械領域廣泛應用。本實驗中，我們驗證了人全血IL-1β試驗應用于醫(yī)療器械熱原檢測的可行性，并對該法中人全血與樣品直接孵育(直接接觸法)測得的內毒素當量和人全血與樣品浸提液孵育(浸提液法)測得量進行了比較與分析。此方法有很好的應用前景，某一試驗樣品在經過特異性確認后，可以應用此方法作為以上兩種方法的替代方法。

2 試驗材料及儀器

2.1 試驗材料

人抗凝新鮮全血(至少4人混合)，無菌無熱原生理鹽水(山東華魯制藥有限公司，批號：1311182161)，人IL-1β ELISA試劑盒(ExCell，批號：ZJBIBZAD03)，脂多糖O113(LPS O113)(LIST BIOLOGICAL，批號：4331B1)，脂磷壁酸(LTA)(SIGMA，批號：044M4000V)，一次性使用無菌無熱原輸液器為市售商品。

2.2 儀器

采血管(BD，K2EDTA，批號：4034487)，采血針(BD，0.6×20mm×180mm，批號：1349187)，無菌無熱原1.5mL反應管(AXYGEN，批號：311-08-081)，15mL反應管(AXYGEN，批號：100525-02904)，微量移液器(eppendorf，1μL-5mL)，無菌無熱原槍頭(200μL，KG1232，批號：130714；1mL，KG1232，批號：130105)，離心機(SIGMA，型號：1-14K)，37°C培養(yǎng)箱(memmert，型號：ICP700)，250°C烘箱(BINDER，型號：FED240)，酶標儀(Thermo，型號：Multiscan MK3)。

3 試驗方法

3.1 樣品制備

在潔凈室潔凈工作臺內用經除熱原處理的手術剪、鑷子(250℃，30 min)剪取無菌無熱原輸液器滴斗部分，裁剪至0.5 cm×0.5 cm大小數(shù)十片備用。用無菌無熱原生理鹽水溶解LPS O113稀釋至2 ng/mL，用微量移液器吸取10 μL溶液小心置于輸液器滴斗小片上，潔凈工作臺內過夜晾干，制備LPS O113陽性樣品A。用無菌無熱原生理鹽水溶解LTA稀釋至2 mg/mL，用微量移液器吸取10 μL溶液小心置于輸液器滴斗小片上，過夜晾干，制備LTA陽性樣品B。孵育前1 h，按照細菌內毒素檢查法要求制備樣品浸提液。取陽性樣品A10片加入1 ml生理鹽水，置于37℃孵育1 h后，震蕩得到樣品浸提液C，同法制備樣品B浸提液D。

3.2 加樣孵育

3.2.1分別將100 μL濃度為0、25、50、100、200、400、800 pg/mL的LPS O113(溶于生理鹽水)加入盛有1 ml生理鹽水的1.5 ml反應管中，標記為R0、R1、R2、R3 、R4、R5、R6，每種濃度平行制備3管，用于制作濃度反應標準曲線。

3.2.2取1.5 ml反應管，加入1.1 ml生理鹽水，再分別加入樣品A、B，各平行制備3管。取1.5 ml反應管，加入1 ml生理鹽水，分別加入樣品A、B，再加入100 μL R3(100 pg/mL)，用于計算內毒素回收率，各平行制備3管標記為A+、B+。取1.5 ml EP管加入1 ml生理鹽水，再分別加入100 μL浸提液C、D，各平行制備3管。另取EP管，加入900 uL生理鹽水，后分別加入100 μL浸提液C、D，再加入100 μL R3(100 pg/mL)，用于計算內毒素回收率，各平行制備3管標記為C+、D+。在加入血液之前，混合物要在無菌操作臺放置至少1 h。

3.2.3選取4名健康志愿者(24-29歲，兩周內未服藥)采用無菌、無熱原抗凝采血管靜脈采血，采血后經白細胞分類計數(shù)排除感染，等體積混合，4 h內使用。將100 μL混勻的抗凝鮮血加入到每一個反應管內，使總體積為1 200 μL，蓋上各反應管，輕輕混勻。

3.2.4將反應管靜置于37℃，5%CO2潮濕培養(yǎng)箱內過夜(14-24 h)，13 000 g離心2 min，取上清。

3.3 檢測

按人IL-1β ELISA試劑盒說明書操作，測定各反應管上清IL-1β的含量。

3.4 計算

3.4.1根據(jù)試劑盒中IL-1β標準品濃度梯度與相應的吸光度值(OD值)建立標準曲線。根據(jù)得到的回歸方程計算各反應管內IL-1β的含量。

3.4.2根據(jù)不同濃度梯度的內毒素O113的量與相應的IL-1β的含量建立標準曲線并計算回歸方程。

3.4.3計算試驗溶液的內毒素當量及其內毒素回收率。當回收率在50%～200%之間，則認為在此試驗條件下，試驗溶液不干擾試驗系統(tǒng)。

3.4.4對直接接觸法測得的內毒素當量和浸提液法測得量進行比較與分析。

4 結果

4.1根據(jù)試劑盒中IL-1β標準品濃度梯度(y)與相應的吸光度值(OD值)(x)建立了標準曲線1(見圖1)。線性回歸方程為：y=400.84x-48.18，R2=0.999。

4.2根據(jù)以上回歸方程計算得到各反應管內IL-1β的含量，根據(jù)不同濃度梯度的內毒素O113的量(x)與相應的IL-1β的含量(y)建立標準曲線(見圖2)，并得到回歸方程：y=226.45Ln(x)-1020.40，R2=0.96。

圖1 IL-1β檢測標準曲線

圖2 IL-1β回歸方程曲線

4.3根據(jù)曲線回歸方程得到了試驗溶液的內毒素當量平均值及回收率見表1。

表1 各試驗溶液內毒素當量及回收率

4.4樣品A、B直接接觸法與浸提液法的測得結果對比見表2。

表2直接接觸法與浸提液法的測得結果對比

Table2Comparisonoftheresultsbetweendirectcontactmethodandextractmethod

樣品直接接觸法結果均值(pg/mL)浸提液法結果均值(pg/mL)內毒素(LPS) O113252.3191.4脂磷壁酸(LTA)113.4119.7

圖3直接接觸法與浸提液法的測得結果對比

Fig3Comparisonoftheresultsbetweendirectcontactmethodandextractmethod

5 討論

人全血IL-1β ELISA法是單核細胞激活試驗(MAT)的一種。熱原物質進入人體后，會激活單核細胞使其釋放IL-1β、IL-6和TNF-α等細胞因子。MAT對以上細胞因子進行定量檢測以間接反映熱原物質的量。其中，IL-1β的檢測具有較高的信噪比，是較好的細胞因子熱原標志物。所以，人全血IL-1β ELISA法是單核細胞激活試驗中最為理想的熱原體外檢測法。

在本實驗中，我們制備了內毒素陽性樣品和非內毒素陽性樣品以及其浸提液。實驗結果證明，以上樣品均能采用人全血IL-1β ELISA法進行檢測。在實際應用過程中，對于一些小型醫(yī)療器械如血管支架、角膜接觸鏡等可以采用直接接觸法；對于不易直接接觸的樣品，可按照內毒素檢查法制備樣品浸提液后，采用此法進行檢測。

本研究表明，在本實驗系統(tǒng)內，100 pg/mL內毒素當量濃度的溶液即可穩(wěn)定刺激人全血釋放出可以檢測到的IL-1β，在采用內毒素檢查法中的細菌內毒素工作標準品替代LPSO113作為本法標準品的試驗中，0.125 EU/mL的濃度即可被檢測出。此試驗的靈敏度完全能夠滿足檢測要求。

本實驗中，內毒素O113陽性樣品組，人全血IL-1β法直接接觸法測得的內毒素當量高于樣品浸提液中的測得量；脂磷壁酸(LTA)陽性樣品組，直接接觸法測得值與浸提液測得值量相當。出現(xiàn)以上結果的原因可能是因為兩種物質的溶解度不同導致的，按現(xiàn)有的浸提方法可能無法保證樣品上的內毒素被完全浸提下來，而脂磷壁酸較易于浸提。研究表明，按照現(xiàn)有的浸提方法無法保證醫(yī)療器械中致熱原，特別是其表面粘附的細菌碎片等殘留物被有效浸提出來[3]，而且有研究發(fā)現(xiàn)，移植物表面粘附的細菌碎片釋放的內毒素是導致移植失敗的重要原因[4]。人全血IL-1βELISA試驗可以通過直接接觸法進行更為有效地檢測，而這一優(yōu)勢是傳統(tǒng)方法所不具備的。

本試驗證明，非內毒素類致熱原如LTA也可使用本方法檢測。本方法檢測譜較寬，能夠刺激人體產生IL-1β的熱原物質，理論上均可通過本法檢測出。另外，本法采用人全血檢測，消除了種屬差異的問題，而且也契合了“3R”原則，有利于動物福利的保護，也符合體外試驗替代動物試驗的大趨勢。

相信經過后續(xù)工作的不斷完善，熱原體外檢測法——人全血IL-1β法能夠應用于醫(yī)療器械生物學安全評價系統(tǒng)中，為醫(yī)療器械的使用提供更為安全有效的保障。