倪從蓉

樂(lè)清市中醫(yī)院，浙江 樂(lè)清325600

高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地葛根中葛根素、大豆苷元的含量

倪從蓉

樂(lè)清市中醫(yī)院，浙江 樂(lè)清325600

目的：建立采用高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地葛根中葛根素、大豆苷元含量的方法，為控制藥材治療提供參考。方法：采用HypersilODS2C18色譜柱，流動(dòng)相為水-甲醇，梯度洗脫，流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，柱溫為室溫。結(jié)果：葛根素在0.020～10.1μg/μL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，平均回收率為99.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.25%；大豆苷元在0.013～6.56μg/μL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，平均回收率為98.9%，RSD為2.43%。結(jié)論：該方法可用于不同產(chǎn)地葛根藥材中葛根素、大豆苷元的含量測(cè)定，且具有簡(jiǎn)便、快捷、重復(fù)性好等特點(diǎn)，可為不同產(chǎn)地葛根質(zhì)量的控制提供依據(jù)。

高效液相色譜法；葛根；葛根素；大豆苷元

葛根為豆科植物甘葛藤（Puerariu thom sonil Benth）的干燥根，在我國(guó)南方地區(qū)分布較廣，具有解肌退熱、生津止渴、通經(jīng)活絡(luò)的功效，臨床主要用于外感發(fā)熱、麻疹不透、眩暈頭痛、中風(fēng)偏癱等［1～3］。現(xiàn)代研究表明，葛根中含有大量的葛根素、大豆苷元等黃酮類(lèi)成分，另含有胡蘿卜素、氨基酸、香豆素類(lèi)等，具有較大的藥用價(jià)值［4］。不同產(chǎn)地葛根中含有的葛根素、大豆苷元、大豆苷等存在較大的差異，直接入藥有可能影響臨床治療的效果［5］。筆者建立高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地葛根中葛根素、大豆苷元含量的方法，為控制葛根的治療提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與儀器

1.1 材料 葛根素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111005-201108）；大豆苷元對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：120916-201106）；不同產(chǎn)地葛根原藥材均購(gòu)自安徽亳州中藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定均為葛根；甲醇（上海振興化工一廠，色譜純，批號(hào)：201213104）；水為超純水；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器 超聲波清洗器（上海必能信超聲有限公司）；Agilent 1100高效液相色譜儀（Agilent 1100色譜泵，Agilent 1100自動(dòng)進(jìn)樣器紫外檢測(cè)器，Agilent 1100色譜工作站）；AL104/01電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)［6］：色譜柱為大連伊力特公司生產(chǎn)的Hypersil ODS2 C18色譜柱；流動(dòng)相為水（A）-甲醇（B），梯度洗脫。

2.2 洗脫程序 見(jiàn)表1。流速：1m L/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，柱溫為室溫，進(jìn)樣體積為20μL。

表1 梯度洗脫程序

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取葛根素對(duì)照品及大豆苷元對(duì)照品適量，置于10m L量瓶中，加30%甲醇溶液適量溶解并定容至刻度，得到葛根素濃度為0.502mg/m L及大豆苷元濃度為0.328m g/m L的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.4 供試品溶液的制備 稱(chēng)取葛根粉末（過(guò)三號(hào)篩）0.8 g，置于100 mL的具塞錐形瓶中，精密加入30%的乙醇50 mL，稱(chēng)定重量后超聲提取30m in，趁熱過(guò)濾，80℃水浴中蒸干，用50%甲醇將將其轉(zhuǎn)溶于50m L的量瓶中，定容即得供試品溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系的考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液0.02、0.05、0.1、0.2、0.5置于10m L的量瓶中，定容。精密吸取各對(duì)照品溶液及對(duì)照品母液20μL，測(cè)定，以濃度）與峰面積（Y）作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)回歸得葛根素及大豆苷元線性方程分別為：Y葛根素=1.1973X+6.3165，R2=0.9968；Y大豆苷元= 1.3625X+7.0082，R2=0.9982。結(jié)果表明，葛根素在0.020～10.1μg/μL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；大豆苷元在0.013～6.56μg/μL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣量均為20μL，測(cè)定葛根素及大豆苷元的峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示葛根素及大豆苷元的RSD值分別為1.96%、1.28%，表明精密度良好，符合含量測(cè)定的要求。

2.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液，每隔2 h精密吸取20μL注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣7次，按照色譜條件測(cè)定葛根素及大豆苷元的峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示葛根素及大豆苷元的RSD值分別為1.52%、1.41%，表明供試品溶液中葛根素及大豆苷元在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品，平行制備5份供試品溶液，分別精密吸取20μL注入高效液相色譜儀，按照色譜條件測(cè)定葛根素及大豆苷元的峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果顯示葛根素及大豆苷元的RSD值分別為1.78%、1.36%，表明用此方法測(cè)定葛根素及大豆苷元的含量重現(xiàn)性良好。

2.5.5 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表2、表3。精密稱(chēng)取已知含量的同一批葛根藥材粉末（過(guò)三號(hào)篩）樣品6份，每份0.2 g，按比例加入葛根素及大豆苷元對(duì)照品制備溶液，分別精密吸取20μL注入高效液相色譜儀，根據(jù)色譜條件測(cè)定葛根素及大豆苷元的峰面積，計(jì)算回收率。

表2 葛根素加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表3 大豆苷元加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4.6 不同產(chǎn)地葛根樣品含量測(cè)定 見(jiàn)表4。制備供試品溶液，根據(jù)色譜條件測(cè)定6個(gè)不同產(chǎn)地葛根樣品中葛根素、大豆苷元的峰面積，按照線性回歸方程，計(jì)算各樣品中葛根素、大豆苷元的含量。

表4 不同產(chǎn)地葛根樣品含量%

3 討論

葛根在我國(guó)大部分地區(qū)均有分布，尤其在南方地區(qū)，如湖南、江西、廣東等，因其具有解表退熱、生津止渴、止瀉等功效，常作為藥食同源的藥材?，F(xiàn)代研究表明，葛根中含有豐富的葛根素、大豆苷元、大豆苷、香豆素、胡蘿卜苷及大量的微量元素，具有非常重要的藥理活性，如葛根素具有提高免疫、增強(qiáng)心肌收縮力、保護(hù)心肌細(xì)胞、降低血壓、抗血小板聚集等藥理活性，臨床常用于各種類(lèi)型心血管疾病的治療；大豆苷元可擴(kuò)張血管、增加冠脈流量、降低血壓、減慢心律和降低心肌耗氧量及抗心律失常作用，臨床常用于治療婦女更年期綜合征、前列腺癌、乳腺癌、心臟病、心血管病等。目前為控制葛根藥材的質(zhì)量，常將葛根素、大豆苷元等主要活性成分作為控制藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)［7］。

文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于葛根素及大豆苷元的提取方法比較多，如考察乙醇、石油醚的提取效果，結(jié)果顯示不同濃度的乙醇對(duì)葛根素及大豆苷元的提取率較高，而石油醚的提取率則幾乎為零，可能與葛根素及大豆苷元分子的極性有較大的關(guān)系［8］。筆者在此基礎(chǔ)上，分別考察了提取溶劑（水、30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇）及提取方法（回流提取、超聲提?。┑奶崛⌒Ч?，結(jié)果顯示以30%乙醇為提取溶劑，超聲30m in可獲得較為滿意的提取效果。

因葛根素、大豆苷元量極性差別比較大，同時(shí)藥材提取物中還含有大量的其它成分，含量測(cè)定時(shí)對(duì)其色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。為了能夠獲得較好的分離效果，筆者考察了洗脫溶劑及洗脫的程序?qū)繙y(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果表明，以水-甲醇為流動(dòng)相，同時(shí)采用梯度洗脫方法對(duì)藥材提取物進(jìn)行分離，可獲得較好的分離效果，且基線較為穩(wěn)定、出峰時(shí)間適當(dāng)，符合含量測(cè)定的基本要求［9］。

本論文建立了葛根素及大豆苷元的高效液相色譜檢測(cè)方法，研究顯示葛根素在0.020～10.1μg/μL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，大豆苷元在0.013～6.56μg/μL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，因此該方法可用檢測(cè)葛根藥材中葛根素、大豆苷元的含量測(cè)定，且具有簡(jiǎn)便、快捷、重復(fù)性好等特點(diǎn)。

經(jīng)對(duì)不同產(chǎn)地葛根中所含有的葛根素及大豆苷元的含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)葛根素及大豆苷元含量的差別比較大，來(lái)自于浙江產(chǎn)地的葛根中葛根素和大豆苷含量高達(dá)6.84%和1.65%，其含量分別為湖南產(chǎn)地的葛根的8.1倍和8.7倍。不同產(chǎn)地葛根中葛根素和大豆苷含量差異顯著的原因可能與不同產(chǎn)地的環(huán)境因素、田間管理、采收加工程序等因素有關(guān)。葛根為豆科植物，其生長(zhǎng)與有效成分的積累與豆瘤菌的關(guān)系較為密切，由于不同產(chǎn)地的環(huán)境差異較大，會(huì)對(duì)豆瘤菌等微生物的生長(zhǎng)繁殖等產(chǎn)生較大的影響。由于葛根素和大豆苷含量有可能影響臨床治療的效果，故為了能夠獲得質(zhì)量較為穩(wěn)定、藥效較好的藥材，應(yīng)該盡量堅(jiān)持藥材的道地性。

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［2］遲霽菲，張國(guó)剛.高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地葛根中葛根素的含量［J］.中南藥學(xué)，2012，4（4）：307-309.

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（責(zé)任編輯：駱歡歡）

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0256-7415（2015）02-0215-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.02.101

2014-09-25

倪從蓉（1974-），女，主管中藥師，研究方向：中藥調(diào)劑。