倪從蓉
樂清市中醫(yī)院,浙江 樂清325600
高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地葛根中葛根素、大豆苷元的含量
倪從蓉
樂清市中醫(yī)院,浙江 樂清325600
目的:建立采用高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地葛根中葛根素、大豆苷元含量的方法,為控制藥材治療提供參考。方法:采用HypersilODS2C18色譜柱,流動(dòng)相為水-甲醇,梯度洗脫,流速:1mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm,柱溫為室溫。結(jié)果:葛根素在0.020~10.1μg/μL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,平均回收率為99.8%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.25%;大豆苷元在0.013~6.56μg/μL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,平均回收率為98.9%,RSD為2.43%。結(jié)論:該方法可用于不同產(chǎn)地葛根藥材中葛根素、大豆苷元的含量測(cè)定,且具有簡(jiǎn)便、快捷、重復(fù)性好等特點(diǎn),可為不同產(chǎn)地葛根質(zhì)量的控制提供依據(jù)。
高效液相色譜法;葛根;葛根素;大豆苷元
葛根為豆科植物甘葛藤(Puerariu thom sonil Benth)的干燥根,在我國(guó)南方地區(qū)分布較廣,具有解肌退熱、生津止渴、通經(jīng)活絡(luò)的功效,臨床主要用于外感發(fā)熱、麻疹不透、眩暈頭痛、中風(fēng)偏癱等[1~3]?,F(xiàn)代研究表明,葛根中含有大量的葛根素、大豆苷元等黃酮類成分,另含有胡蘿卜素、氨基酸、香豆素類等,具有較大的藥用價(jià)值[4]。不同產(chǎn)地葛根中含有的葛根素、大豆苷元、大豆苷等存在較大的差異,直接入藥有可能影響臨床治療的效果[5]。筆者建立高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地葛根中葛根素、大豆苷元含量的方法,為控制葛根的治療提供參考,現(xiàn)報(bào)道如下。
1.1 材料 葛根素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):111005-201108);大豆苷元對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):120916-201106);不同產(chǎn)地葛根原藥材均購(gòu)自安徽亳州中藥材市場(chǎng),經(jīng)鑒定均為葛根;甲醇(上海振興化工一廠,色譜純,批號(hào):201213104);水為超純水;其它試劑均為分析純。
1.2 儀器 超聲波清洗器(上海必能信超聲有限公司);Agilent 1100高效液相色譜儀(Agilent 1100色譜泵,Agilent 1100自動(dòng)進(jìn)樣器紫外檢測(cè)器,Agilent 1100色譜工作站);AL104/01電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。
2.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)[6]:色譜柱為大連伊力特公司生產(chǎn)的Hypersil ODS2 C18色譜柱;流動(dòng)相為水(A)-甲醇(B),梯度洗脫。
2.2 洗脫程序 見表1。流速:1m L/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm,柱溫為室溫,進(jìn)樣體積為20μL。
表1 梯度洗脫程序
2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取葛根素對(duì)照品及大豆苷元對(duì)照品適量,置于10m L量瓶中,加30%甲醇溶液適量溶解并定容至刻度,得到葛根素濃度為0.502mg/m L及大豆苷元濃度為0.328m g/m L的混合對(duì)照品溶液,備用。
2.4 供試品溶液的制備 稱取葛根粉末(過三號(hào)篩)0.8 g,置于100 mL的具塞錐形瓶中,精密加入30%的乙醇50 mL,稱定重量后超聲提取30m in,趁熱過濾,80℃水浴中蒸干,用50%甲醇將將其轉(zhuǎn)溶于50m L的量瓶中,定容即得供試品溶液。
2.5 方法學(xué)考察
2.5.1 線性關(guān)系的考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液0.02、0.05、0.1、0.2、0.5置于10m L的量瓶中,定容。精密吸取各對(duì)照品溶液及對(duì)照品母液20μL,測(cè)定,以濃度)與峰面積(Y)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線,經(jīng)回歸得葛根素及大豆苷元線性方程分別為:Y葛根素=1.1973X+6.3165,R2=0.9968;Y大豆苷元= 1.3625X+7.0082,R2=0.9982。結(jié)果表明,葛根素在0.020~10.1μg/μL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系;大豆苷元在0.013~6.56μg/μL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。
2.5.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,每次進(jìn)樣量均為20μL,測(cè)定葛根素及大豆苷元的峰面積,計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示葛根素及大豆苷元的RSD值分別為1.96%、1.28%,表明精密度良好,符合含量測(cè)定的要求。
2.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液,每隔2 h精密吸取20μL注入高效液相色譜儀,連續(xù)進(jìn)樣7次,按照色譜條件測(cè)定葛根素及大豆苷元的峰面積,計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示葛根素及大豆苷元的RSD值分別為1.52%、1.41%,表明供試品溶液中葛根素及大豆苷元在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.5.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品,平行制備5份供試品溶液,分別精密吸取20μL注入高效液相色譜儀,按照色譜條件測(cè)定葛根素及大豆苷元的峰面積,計(jì)算含量。結(jié)果顯示葛根素及大豆苷元的RSD值分別為1.78%、1.36%,表明用此方法測(cè)定葛根素及大豆苷元的含量重現(xiàn)性良好。
2.5.5 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見表2、表3。精密稱取已知含量的同一批葛根藥材粉末(過三號(hào)篩)樣品6份,每份0.2 g,按比例加入葛根素及大豆苷元對(duì)照品制備溶液,分別精密吸取20μL注入高效液相色譜儀,根據(jù)色譜條件測(cè)定葛根素及大豆苷元的峰面積,計(jì)算回收率。
表2 葛根素加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)
表3 大豆苷元加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
2.4.6 不同產(chǎn)地葛根樣品含量測(cè)定 見表4。制備供試品溶液,根據(jù)色譜條件測(cè)定6個(gè)不同產(chǎn)地葛根樣品中葛根素、大豆苷元的峰面積,按照線性回歸方程,計(jì)算各樣品中葛根素、大豆苷元的含量。
表4 不同產(chǎn)地葛根樣品含量%
葛根在我國(guó)大部分地區(qū)均有分布,尤其在南方地區(qū),如湖南、江西、廣東等,因其具有解表退熱、生津止渴、止瀉等功效,常作為藥食同源的藥材?,F(xiàn)代研究表明,葛根中含有豐富的葛根素、大豆苷元、大豆苷、香豆素、胡蘿卜苷及大量的微量元素,具有非常重要的藥理活性,如葛根素具有提高免疫、增強(qiáng)心肌收縮力、保護(hù)心肌細(xì)胞、降低血壓、抗血小板聚集等藥理活性,臨床常用于各種類型心血管疾病的治療;大豆苷元可擴(kuò)張血管、增加冠脈流量、降低血壓、減慢心律和降低心肌耗氧量及抗心律失常作用,臨床常用于治療婦女更年期綜合征、前列腺癌、乳腺癌、心臟病、心血管病等。目前為控制葛根藥材的質(zhì)量,常將葛根素、大豆苷元等主要活性成分作為控制藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)[7]。
文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于葛根素及大豆苷元的提取方法比較多,如考察乙醇、石油醚的提取效果,結(jié)果顯示不同濃度的乙醇對(duì)葛根素及大豆苷元的提取率較高,而石油醚的提取率則幾乎為零,可能與葛根素及大豆苷元分子的極性有較大的關(guān)系[8]。筆者在此基礎(chǔ)上,分別考察了提取溶劑(水、30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇)及提取方法(回流提取、超聲提取)的提取效果,結(jié)果顯示以30%乙醇為提取溶劑,超聲30m in可獲得較為滿意的提取效果。
因葛根素、大豆苷元量極性差別比較大,同時(shí)藥材提取物中還含有大量的其它成分,含量測(cè)定時(shí)對(duì)其色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。為了能夠獲得較好的分離效果,筆者考察了洗脫溶劑及洗脫的程序?qū)繙y(cè)定結(jié)果的影響,結(jié)果表明,以水-甲醇為流動(dòng)相,同時(shí)采用梯度洗脫方法對(duì)藥材提取物進(jìn)行分離,可獲得較好的分離效果,且基線較為穩(wěn)定、出峰時(shí)間適當(dāng),符合含量測(cè)定的基本要求[9]。
本論文建立了葛根素及大豆苷元的高效液相色譜檢測(cè)方法,研究顯示葛根素在0.020~10.1μg/μL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,大豆苷元在0.013~6.56μg/μL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,因此該方法可用檢測(cè)葛根藥材中葛根素、大豆苷元的含量測(cè)定,且具有簡(jiǎn)便、快捷、重復(fù)性好等特點(diǎn)。
經(jīng)對(duì)不同產(chǎn)地葛根中所含有的葛根素及大豆苷元的含量測(cè)定,發(fā)現(xiàn)葛根素及大豆苷元含量的差別比較大,來自于浙江產(chǎn)地的葛根中葛根素和大豆苷含量高達(dá)6.84%和1.65%,其含量分別為湖南產(chǎn)地的葛根的8.1倍和8.7倍。不同產(chǎn)地葛根中葛根素和大豆苷含量差異顯著的原因可能與不同產(chǎn)地的環(huán)境因素、田間管理、采收加工程序等因素有關(guān)。葛根為豆科植物,其生長(zhǎng)與有效成分的積累與豆瘤菌的關(guān)系較為密切,由于不同產(chǎn)地的環(huán)境差異較大,會(huì)對(duì)豆瘤菌等微生物的生長(zhǎng)繁殖等產(chǎn)生較大的影響。由于葛根素和大豆苷含量有可能影響臨床治療的效果,故為了能夠獲得質(zhì)量較為穩(wěn)定、藥效較好的藥材,應(yīng)該盡量堅(jiān)持藥材的道地性。
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(責(zé)任編輯:駱歡歡)
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0256-7415(2015)02-0215-03
10.13457/j.cnki.jncm.2015.02.101
2014-09-25
倪從蓉(1974-),女,主管中藥師,研究方向:中藥調(diào)劑。