枇杷花總黃酮、總?cè)频拇罂讟渲苽涔に?/h1>
2015-10-18 06:26:11黃春萍張曉峰
食品科學(xué) 2015年18期
陳 晶，李 琪，黃春萍，張曉峰，徐 艷，丁 然，張 宏，3，*
（1.四川師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610068；2.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101；3.四川師范大學(xué)植物資源應(yīng)用與開發(fā)研究所，四川 成都 610101）
枇杷花總黃酮、總?cè)频拇罂讟渲苽涔に?/p>
陳 晶1，李 琪2，黃春萍2，張曉峰2，徐 艷2，丁 然2，張 宏2，3，*
（1.四川師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610068；2.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101；3.四川師范大學(xué)植物資源應(yīng)用與開發(fā)研究所，四川 成都 610101）
以枇杷花中總黃酮、總?cè)坪孔鳛闄z測指標(biāo)，考察D101、AB-8、聚酰胺3 種大孔樹脂對枇杷花提取物中總黃酮、總?cè)频姆蛛x性能，考察4 種不同干燥方法對枇杷花總黃酮、總?cè)坪康挠绊憽＝Y(jié)果表明，大孔樹脂AB-8作為最佳分離樹脂，上樣量2.1 mL、吸附時(shí)間4 h、洗脫速率2 BV/h、洗脫體積3 BV時(shí)，枇杷花洗脫液中總黃酮含量為74.82%，收率為76.56%，總?cè)坪繛?5.57%，收率為46.48%；減壓干燥作為最佳干燥方法，真空度0.07 MPa、溫度45 ℃、干燥時(shí)間10 h時(shí)，純化物中總黃酮含量為76.07%，收率為77.87%，總?cè)坪繛?5.89%，收率為47.09%，含水量為4.07%。研究結(jié)果表明，此制備工藝可行，為枇杷花總黃酮、總?cè)频拈_發(fā)利用提供理論依據(jù)。
枇杷花；總黃酮；總?cè)?；分離純化；干燥
枇杷花作為我國的民間用藥，已有多年歷史。據(jù)相關(guān)資料記載，枇杷花性溫和而不燥、驅(qū)寒化痰，有溫肺、止咳、祛痰之功效，對感冒、咳嗽等疾病有著顯著的療效［1-3］。據(jù)文獻(xiàn)［4-7］報(bào)道，枇杷花中的主要化學(xué)成分有黃酮類、三萜類、多酚類、有機(jī)酸以及揮發(fā)性成分等。由于其具有多種生物活性成分，可以用于治療多種疾病，包括鎮(zhèn)咳、抗炎、抗腫瘤、糖尿病等［8-12］。經(jīng)研究［13-16］發(fā)現(xiàn)，枇杷花的止咳祛痰效果起顯著作用的是黃酮類和三萜類化合物。
近年來，采用大孔樹脂分離純化總黃酮、總?cè)频难芯浚?7-21］越來越多。丁然等［22］考察了D-101、D-160、AB-8、NKA-9和聚酰胺5 種吸附樹脂對枇杷花總黃酮的吸附與解吸附性能，篩選出性能較好的AB-8用于枇杷花提取物中總黃酮的分離純化；楊曉艷等［23］通過研究發(fā)現(xiàn)AB-8大孔樹脂適于分離純化莢果蕨總?cè)疲谧顑?yōu)條件下總?cè)苹厥章蕿?6.27%，純化倍數(shù)為2.88，但是少有同時(shí)分離純化枇杷花中總黃酮、總?cè)频难芯?。本?shí)驗(yàn)篩選擇了3 種常見的吸附樹脂，并通過對洗脫溶劑、洗脫速率、吸附時(shí)間等因素的考察，確定了枇杷花總黃酮、總?cè)频募兓に嚕豢疾炝? 種干燥方法對枇杷花總黃酮、總?cè)坪康挠绊?，確定了最優(yōu)干燥條件。本實(shí)驗(yàn)使用大孔樹脂對枇杷花中總黃酮和總?cè)苾深惢衔锿瑫r(shí)進(jìn)行分離純化，并對枇杷花分離純化物進(jìn)行干燥方法研究，為枇杷花的后期研究提供一定的理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
枇杷花2010年10月采于四川攀枝花，經(jīng)烘箱80 ℃烘干、粉碎后備用。
熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所；D-101大孔吸附樹脂（純凈級） 山東魯抗立科藥業(yè)有限公司；AB-8、聚酰胺樹脂（純凈級） 滄州寶恩吸附材料科技有限公司；95%乙醇（食品級）、其余試劑（均為分析純） 成都市科龍化工試劑廠。
1.2儀器與設(shè)備
UV-1700紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；BP211D十萬分之一天平 德國Sartoo-Rius公司；Ad Vantage冷凍干燥儀 美國Vir Tis公司；B-290噴霧干燥儀 瑞士Büchi公司。
1.3方法
1.3.1枇杷花提取物中總黃酮、總?cè)坪康臏y定
1.3.1.1供試品溶液制備
精密稱取枇杷花300 g，按照固液比1∶10加入50%乙醇溶液，在提取溫度80 ℃、提取時(shí)間2 h的條件下，回流提取2次，抽濾，合并濾液，減壓濃縮至一定量后定容于50 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻即得。
1.3.1.2枇杷花提取物中總黃酮、總?cè)茦?biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
精密稱取蘆丁對照品10.88 mg、熊果酸對照品11.19 mg，分別用50%乙醇溶液定容于50 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為217.6 mg/L和223.8 mg/L的對照品溶液。參考文獻(xiàn)［24-25］繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得蘆丁線性方程：Y=0.011 72A-0.004 65，R2=0.999 9，線性范圍為2.176～108.8 mg/L；熊果酸線性方程Y=0.011 37A-0.062 18，R2=0.999 9，線性范圍為22.3～223.8 mg/L。其中Y代表質(zhì)量濃度，A代表吸光度。
1.3.1.3樣品測定
精密移取枇杷花提取液1.0 mL至50 mL容量瓶中，用50%乙醇溶液稀釋至刻度，取1 mL稀釋液按1.3.1.2節(jié)方法測定吸光度，根據(jù)線性方程計(jì)算總黃酮、總?cè)频馁|(zhì)量濃度。
1.3.1.4總黃酮和總?cè)坪康挠?jì)算
枇杷花提取液中總黃酮的含量（W1）為：
枇杷花提取液中總?cè)频暮浚╓2）為：
枇杷花純化物中總黃酮的含量（W1′）為：
枇杷花純化物中總?cè)频暮浚╓2′）為：
枇杷花純化物中總黃酮的收率（S1）為：
枇杷花純化物中總?cè)频氖章剩⊿2）為：
式（1）～（6）中：Y1、Y2為枇杷花提取液的總黃酮、總?cè)瀑|(zhì)量濃度/（mg/L），D1、D2為提取液體積/L；M為原材料質(zhì)量/g；Y1′、Y2′為枇杷花純化物的總黃酮、總?cè)瀑|(zhì)量濃度/（mg/L），D1′、D2′為純化液體積/L；M′為純化物質(zhì)量/g；m1、m2為枇杷花純化物中總黃酮、總?cè)频馁|(zhì)量/g；m1′、m2′為用于分離純化的枇杷花提取物中總黃酮、總?cè)频馁|(zhì)量/g。
1.3.2吸附樹脂的預(yù)處理
表1 3 種大孔樹脂的物理性能Table 1 Physical properties of three macroporous resins
取3 種型號的吸附樹脂D-101、AB-8、聚酰胺（物理性能見表1），用95%乙醇溶液浸泡24 h后裝柱，用蒸餾水沖洗樹脂至流出液澄清且不再含有乙醇。依次以2 BV/h的速率用5%鹽酸溶液、5%氫氧化鈉溶液沖洗樹脂，直至流出液呈中性后用95%乙醇溶液浸泡備用。
1.3.3大孔吸附樹脂的篩選
將預(yù)處理好的D-101、AB-8、聚酰胺3 種吸附樹脂分別裝入柱體積為90 mL的玻璃層析柱。先用蒸餾水洗脫樹脂直至流出液澄清，再準(zhǔn)確移取1.7 mL枇杷花提取物溶液上樣，依次用蒸餾水、95%乙醇溶液洗脫樣品。按1.3.1節(jié)方法測定各洗脫片段中總黃酮、總?cè)频暮坎⒂?jì)算收率。
1.3.4洗脫溶劑對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊?/p>
準(zhǔn)確移取1.7 mL枇杷花提取物溶液上樣AB-8大孔樹脂層析柱后，控制洗脫速率為2 BV/h（2 BV為2 倍柱體積），依次用蒸餾水、50%乙醇溶液、95%乙醇溶液洗脫樣品，每個(gè)片段洗脫4 BV，分別收集3 個(gè)洗脫片段。各洗脫片段經(jīng)減壓濃縮后放入60 ℃烘箱干燥。按1.3.1節(jié)方法測定各洗脫片段中總黃酮、總?cè)频暮坎⒂?jì)算收率。
1.3.5枇杷花提取物中總黃酮、總?cè)萍兓に噧?yōu)化
1.3.5.1單因素試驗(yàn)
1）上樣量對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊懀簻?zhǔn)確移取枇杷花提取物溶液0.8、1.2、1.7、2.1、2.9、3.8 mL，分別上樣AB-8大孔樹脂層析柱，吸附4 h后，按1.3.4節(jié)方法進(jìn)行洗脫，收集50%乙醇溶液洗脫片段，經(jīng)減壓濃縮后放入60 ℃烘箱內(nèi)干燥。按1.3.1節(jié)方法測定50%洗脫片段中總黃酮、總?cè)频暮坎⒂?jì)算收率。2）洗脫速率對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊懀簻?zhǔn)確移取枇杷花提取物溶液2.1 mL上樣AB-8大孔樹脂層析柱，吸附4 h后，控制洗脫速率分別為0.5、2、4 BV/h，按1.3.4節(jié)方法進(jìn)行洗脫，后續(xù)操作同上。3）吸附時(shí)間對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊懀簻?zhǔn)確移取枇杷花提取物溶液2.1 mL上樣AB-8大孔樹脂層析柱，分別吸附樣品2、4、8、16、24 h后，按1.3.4節(jié)方法進(jìn)行洗脫，后續(xù)操作同上。4）洗脫體積對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊懀簻?zhǔn)確移取枇杷花提取物溶液2.1 mL上樣AB-8大孔樹脂層析柱，吸附4 h后，按1.3.4節(jié)方法進(jìn)行洗脫，各片段分別洗脫2、3、4、5、6 BV，后續(xù)操作同上。
1.3.5.2正交試驗(yàn)
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取上樣量、洗脫速率、吸附時(shí)間、洗脫體積4 個(gè)因素，每個(gè)因素考察3 個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以50%乙醇溶液洗脫片段中總黃酮收率作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。正交試驗(yàn)因素水平見表2。
表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels used in orthogonal array design
1.3.5.3最佳純化工藝條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
按1.3.5.2節(jié)所確定的最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（n=3）。按1.3.1節(jié)方法測定50%乙醇溶液洗脫片段中總黃酮、總?cè)频暮坎⒂?jì)算收率。
1.3.6枇杷花純化物的干燥工藝
按1.3.5節(jié)所確定的純化條件對枇杷花提取物進(jìn)行分離純化，收集50%乙醇溶液洗脫片段，減壓濃縮至浸膏。精確量取浸膏50 mL作為一個(gè)待測樣品。分別進(jìn)行不同方式的干燥：常壓干燥，溫度設(shè)定為40、60、80 ℃；減壓干燥，真空度設(shè)定為0.07 MPa，溫度為45、55、65 ℃；冷凍干燥，升華溫度設(shè)為30、40、50 ℃；噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為120、140、160、180 ℃，霧化器轉(zhuǎn)速28 000 r/min，流量為0.9 mL/min。收集干粉，稱質(zhì)量。記錄干燥至固體狀態(tài)所需時(shí)間，按1.3.1節(jié)方法測定樣品中總黃酮、總?cè)频暮坎⒂?jì)算收率。
2 結(jié)果與分析
2.1提取溶劑體積分?jǐn)?shù)對枇杷花總黃酮、總?cè)坪康挠绊?/p>
總黃酮、總?cè)频臉O性有一定的差異，為了同時(shí)提取枇杷花中的總黃酮、總?cè)?，本?shí)驗(yàn)考察了兩種不同的提取方法，即50%乙醇溶液提取2 次和50%、95%乙醇溶液分別提取1 次。由表3可知，50%乙醇提取物中枇杷花總黃酮的含量明顯較高，而總?cè)频暮縿t略低于混合95%、50%乙醇溶液提取物。因此本實(shí)驗(yàn)選取50%乙醇溶液作為樣品的提取溶劑。
表3 提取溶劑體積分?jǐn)?shù)對枇杷花提取物中總黃酮、總?cè)坪康挠绊慣able 3 Effect of extraction solvents on the contents of flfl avonoids and triterpene
表3 提取溶劑體積分?jǐn)?shù)對枇杷花提取物中總黃酮、總?cè)坪康挠绊慣able 3 Effect of extraction solvents on the contents of flfl avonoids and triterpene
提取溶劑50%乙醇溶液95%乙醇溶液和50%乙醇溶液總黃酮含量20.36±0.33516.76±0.344總?cè)坪?.867±0.3017.403±0.340
2.23 種吸附樹脂對枇杷花總黃酮、總?cè)频募兓Ч?/p>
表4 3 種樹脂對總黃酮、總?cè)频姆蛛x純化效果Table 4 Effect of three resins on separation and purififi cation of flfl avonoids and triterpenoi
表4 3 種樹脂對總黃酮、總?cè)频姆蛛x純化效果Table 4 Effect of three resins on separation and purififi cation of flfl avonoids and triterpenoi
D-101AB-8聚酰胺總黃酮含量水洗脫片段3.682±1.3114.113±1.1231.020±1.421 95%乙醇洗脫片段50.67±0.21555.01±0.21128.97±0.652總黃酮收率各洗脫片段收率之和56.70±0.41758.21±0.52332.89±0.313總?cè)坪克疵撈?.265±2.2371.312±1.3340.724±2.533 95%乙醇洗脫片段18.16±0.14518.37±0.1128.712±0.421總?cè)剖章矢飨疵撈问章手?4.69±0.20446.43±0.19313.58±0.501
由表4可知，3 種樹脂分離純化枇杷花總黃酮、總?cè)频哪芰Υ笮№樞驗(yàn)锳B-8＞D-101＞聚酰胺。聚酰胺樹脂由于極性較大，吸附性能強(qiáng)而解吸性能較弱，樣品很難從樹脂上洗脫下來。D-101大孔樹脂在吸附及解吸性能上略低于AB-8大孔樹脂，所以選擇AB-8大孔樹脂作為吸附材料。
2.3洗脫方法對枇杷花總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊?/p>
5 各洗脫片段的總黃酮、總?cè)坪考笆章剩▁ =3）Table 5 Contents and yields of flfl avonoids and triterpenes in the eluted fractions （x ± ， = 3）
5 各洗脫片段的總黃酮、總?cè)坪考笆章剩▁ =3）Table 5 Contents and yields of flfl avonoids and triterpenes in the eluted fractions （x ± ， = 3）
%方法1方法2水洗脫片段95%乙醇溶液95%乙醇溶液洗脫片段總黃酮含量4.295±1.11053.51±1.0113.872±1.01369.11±0.431 7.072±1.231總黃酮收率57.43±0.23175.21±0.211總?cè)坪?.197±1.002 18.84±1.6711.059±1.241 15.14±0.321 4.213±1.523總?cè)剖章?6.22±1.02145.27±1.101洗脫片段水洗脫片段50%乙醇溶液洗脫片段
由表5可知，50%乙醇溶液洗脫片段的總黃酮含量及收率遠(yuǎn)高于方法1中95%乙醇洗脫片段，總?cè)坪考笆章蕜t略低?？紤]到總黃酮在枇杷花中的含量高于總?cè)疲?0%乙醇溶液洗脫片段既能得到較高的總黃酮含量及收率，也能滿足總?cè)坪考笆章实囊?。因此選用洗脫方法2對枇杷花提取物進(jìn)行純化，洗脫片段分為水洗脫片段、50%乙醇溶液洗脫片段、95%乙醇洗脫片段。從表5可以看出，方法2中水洗脫片段、95%乙醇洗脫片段得到的總黃酮總?cè)坪烤^低，對收率的影響很小，因此用50%乙醇溶液洗脫片段中總黃酮、總?cè)频暮考笆章首鳛楹罄m(xù)實(shí)驗(yàn)的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。
2.4AB-8大孔樹脂分離純化枇杷花總黃酮、總?cè)圃囼?yàn)優(yōu)化
2.4.1單因素試驗(yàn)結(jié)果
2.4.1.1上樣量的選擇
圖1 上樣量對總黃酮、總?cè)坪亢褪章实挠绊慒ig.1 Effect of sample volume on the contents of fl avonoids and triterpenes and their yields
由圖1可以看出，上樣量對枇杷花提取物中總黃酮、總?cè)坪考笆章视酗@著影響。隨著上樣量的增加，樣品中總黃酮、總?cè)频暮亢褪章室仓饾u增加。當(dāng)上樣量為2.1 mL時(shí)，樣品中總黃酮、總?cè)频暮考笆章识歼_(dá)到最大值。當(dāng)上樣量繼續(xù)增加時(shí)，樣品的純度及收率都大大降低，開始出現(xiàn)泄漏趨勢。2.1 mL是樹脂的最大承載量，因此初步選擇2.1 mL為最佳上樣量。
2.4.1.2洗脫速率的選擇
圖2 洗脫速率對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊慒ig.2 Effect of elution fl ow rate on the contents of fl avonoids and triterpenes and their yields
如圖2所示，當(dāng)洗脫速率為0.5 BV/h時(shí)，總黃酮、總?cè)坪考笆章示愿哂谙疵撍俾? BV/h，但是2 BV/h的洗脫速率可以減少洗脫時(shí)間，提高洗脫效率。因此選擇洗脫速率為2 BV/h。
2.4.1.3吸附時(shí)間的選擇
圖3 吸附時(shí)間對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊慒ig.3 Effect of adsorption time on the contents of fl avonoids and triterpenes and their yields
由圖3可以看出，總黃酮、總?cè)坪考笆章氏入S著吸附時(shí)間的延長而增加，當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)到4 h時(shí)，樹脂達(dá)到飽和狀態(tài)，含量及收率達(dá)到最大值。隨著吸附時(shí)間的延長，總黃酮、總?cè)坪考笆章蕩缀醪辉僮兓?。因此選擇吸附時(shí)間為4 h。
2.4.1.4洗脫體積的選擇
圖4 洗脫體積對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊慒ig.4 Effect of elution volume on the contents of fl avonoids and triterpenes and their yields
由圖4可以看出，總黃酮及總?cè)频暮考笆章孰S著洗脫體積的增加而增加。當(dāng)洗脫體積達(dá)到3、4 BV時(shí)，總黃酮、總?cè)坪考笆章示^高。隨著洗脫體積的增加，總黃酮、總?cè)坪考笆章食氏陆第厔荩@是因?yàn)橄疵撓聛淼碾s質(zhì)的含量增加導(dǎo)致的。當(dāng)洗脫體積為3 BV和4 BV時(shí)，總黃酮、總?cè)坪考笆章蕩缀跸嗤紤]到減少洗脫劑用量，減少成本，故選擇洗脫體積為3 BV。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果可知：影響AB-8大孔樹脂分離純化性能的因素有上樣量、洗脫速率、吸附時(shí)間和洗脫體積；且根據(jù)純化后總黃酮和總?cè)坪考笆章实淖兓醪秸J(rèn)為各因素對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊憺椋荷蠘恿浚鞠疵撍俾剩鞠疵擉w積＞吸附時(shí)間。
2.4.2正交試驗(yàn)結(jié)果
表6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Results of orthogonal array design
由表6可知，各因素對枇杷花提取物總黃酮收率影響的大小為：上樣量＞洗脫速率＞洗脫體積＞吸附時(shí)間，其中上樣量對總黃酮收率的影響最大，吸附時(shí)間對總黃酮收率的影響最小。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，最佳優(yōu)選工藝組合是A2B1C2D2，即上樣量2.1 mL、洗脫速率0.5 BV/h、吸附時(shí)間4 h、洗脫體積3 BV。根據(jù)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，洗脫速率為0.5 BV/h和2 BV/h時(shí)，總黃酮收率相近，而0.5 BV/h的洗脫速率較慢，影響工作效率，不適宜工業(yè)化生產(chǎn)。故最終選擇工藝組合是A2B2C2D2。正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見表7。
表7 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 7 Analysis of variance for the orthogonal array design
2.4.3樹脂最佳工藝條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
按1.3.5.2節(jié)所確定的最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（n=3），測得枇杷花提取物的50%乙醇溶液洗脫片段中總黃酮的含量為74.82%，收率為76.56%，總?cè)频暮繛?5.57%，收率為46.48%，其總黃酮和總?cè)频暮亢褪章示^高。結(jié)果表明，正交試驗(yàn)所得工藝條件最優(yōu)。
2.5枇杷花純化物干燥工藝
2.5.1常壓干燥溫度的選擇
表8 常壓干燥溫度對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊慣able 8 Effect of atmospheric drying temperature on the contents of fl avonoids and triterpenes and their yields
由表8可知，當(dāng)烘箱溫度為40 ℃和60 ℃時(shí)，總黃酮、總?cè)坪亢褪章氏嘟?，?dāng)溫度為80℃時(shí)，總黃酮、總?cè)频暮棵黠@降低，這是因?yàn)闇囟冗^高，樣品的有效成分遭到部分破壞。40 ℃時(shí)的含量和收率略低于60 ℃，干燥耗時(shí)較長。從干燥后樣品的含水量來看，當(dāng)干燥溫度為60、80 ℃時(shí)，含水量相近且比溫度為40 ℃時(shí)較低。綜合有效物質(zhì)的含量及收率、干燥耗時(shí)及含水量，選擇60 ℃作為常壓干燥的最佳溫度。
2.5.2減壓干燥條件的選擇
表9 減壓干燥溫度總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊慣able 9 Effect of vacuum drying temperature on the contents and yields of fl avonoids and triterpenes
由表9可以看出，在不同干燥溫度條件下，樣品干燥后含水量相當(dāng)。當(dāng)干燥溫度為45 ℃時(shí)，枇杷花總黃酮、總?cè)坪?、收率均較高。因此選擇干燥溫度為45 ℃。
2.5.3冷凍干燥條件的選擇
表10 真空冷凍干燥升華溫度總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊慣able 10 Effect of sublimation temperature of freeze-drying on the contents of fl avonoids and triterpenes and their yields
由表10可以看出，當(dāng)升華溫度為30、40 ℃時(shí)，枇杷花總黃酮和總?cè)坪俊⑹章始案稍锖髽悠返暮烤喈?dāng)，但用40 ℃進(jìn)行干燥時(shí)，可以縮短干燥時(shí)間；當(dāng)溫度升高至50 ℃時(shí)，對縮短凍干時(shí)間沒有實(shí)質(zhì)性影響，反而降低了總黃酮和總?cè)频暮亢褪章?。因此?shí)驗(yàn)確定升華溫度為40 ℃。
2.5.4噴霧干燥條件的選擇噴霧干燥耗時(shí)均約為1 h，由表11可以看出，干燥后樣品的含水量隨進(jìn)風(fēng)溫度的增加而降低，但下降趨勢隨進(jìn)風(fēng)溫度升高而減弱。當(dāng)進(jìn)風(fēng)溫度低于140 ℃時(shí)，有部分樣品在噴霧塔內(nèi)壁附著，所得樣品含水量比較大。當(dāng)進(jìn)風(fēng)溫度超過180 ℃時(shí)，樣品含水量雖然較小，但卻造成枇杷花止咳有效成分的損失，因此進(jìn)風(fēng)溫度不宜太高。確定進(jìn)風(fēng)溫度為160 ℃，出風(fēng)溫度為80 ℃時(shí)，產(chǎn)品質(zhì)量較高。
表11 噴霧干燥進(jìn)風(fēng)溫度對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊慣able 11 Effect of inlet temperature of spray drying on the contents of fl avonoids and triterpenes and their yields
2.5.54 種干燥方法的綜合比較
表12 干燥方法對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊慣able 12 Effect of different drying methods on the contents of fl avonoids and triterpenes and their yields
為比較4 種干燥方法的優(yōu)劣，各取其最佳條件來進(jìn)行比較，結(jié)果見表12。根據(jù)樣品中總黃酮、總?cè)坪?、收率以及樣品含水量來比較4 種干燥方法的干燥效果，冷凍干燥的效果最好，減壓干燥次之。噴霧干燥的效果較常壓干燥要好。冷凍干燥時(shí)由于低溫條件下各種化學(xué)反應(yīng)的速率低，樣品有效成分也不易遭到破壞。就干燥耗時(shí)而言，噴霧干燥耗時(shí)最短。減壓干燥使水的沸點(diǎn)降低，傳熱溫差增大，傳熱效率提高，達(dá)到相同干燥程度時(shí)，減壓干燥比常壓干燥所需時(shí)間少。冷凍干燥過程較其他幾種干燥方法復(fù)雜，所需干燥時(shí)間最長。經(jīng)冷凍干燥后樣品中有效成分的品質(zhì)最好，但該法需要的干燥條件較為苛刻，且設(shè)備昂貴，周期長，成本高?？紤]到后續(xù)實(shí)驗(yàn)，選擇減壓干燥作為干燥枇杷花總黃酮、總?cè)频姆椒ā?/p>
3 結(jié) 論
本實(shí)驗(yàn)對枇杷花中有效成分的制備工藝進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AB-8大孔樹脂比較適合于枇杷花中有效成分的分離純化，純化工藝參數(shù)為上樣量2.1 mL、洗脫速率2 BV/h、吸附時(shí)間4 h、洗脫體積3 BV，在此條件下得到的總黃酮含量為74.82%，收率為76.56%，總?cè)坪繛?5.57%，收率為46.48%；減壓干燥適用于干燥枇杷花中總黃酮、總?cè)?，干燥條件為真空度0.07 MPa、溫度45 ℃、干燥耗時(shí)10 h，所得樣品總黃酮含量為76.07%，收率為77.87%，總?cè)坪繛?5.89%，收率為47.09%，含水量為4.07%。
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Preparation of Flavonoids and Triterpenoids from Flowers of Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl by Macroporous Resins
CHEN Jing1， LI Qi2， HUANG Chunping2， ZHANG Xiaofeng2， XU Yan2， DING Ran2， ZHANG Hong2，3，*
（1. College of Chemistry and Materials Science， Sichuan Normal University， Chengdu 610068， China；2. College of Life Sciences， Sichuan Normal University， Chengdu 610101， China；
3. Institute of Application and Development of Plant Resources， Sichuan Normal University， Chengdu 610101， China）
The total fl avonoids and triterpenoids of loquat fl ower extracts were purifi ed with D101， AB-8 and polyamide resins and dried by atmospheric drying， vacuum drying， freeze drying and spray drying， respectively. The effectiveness of these methods was tested based on the content and yield of total fl avonoids and triterpenoids. The results showed that AB-8 was the best macroporous resin for the separation and purifi cation of fl avonoids and triterpenoids， and vacuum drying was the best drying method. The optimal conditions for purifi cation were determined as follows： sample volume， 2.1 mL；elution fl ow rate， 2 BV/h； adsorption time， 4 h； and eluent volume， 3 BV. Under these conditions， the content and yield of fl avonoids were 74.82% and 76.56% and the content and yield of triterpenoids were 15.57% and 46.48%， respectively. The optimal conditions for vacuum drying were obtained by 10 h drying at 45 ℃ with a vacuum degree of 0.07 MPa. Under the optimized drying conditions， fl avonoids content was 76.07% with a yield of 77.87%， triterpenoids content was 15.89% with a yield of 47.09% and moisture content was 4.07%.
loquat fl owers； fl avonoids； triterpenoids； separation and purifi cation； drying
R284.2
A
1002-6630（2015）18-0058-06
10.7506/spkx1002-6630-201518010
2015-01-29
四川省科技廳第三批應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目（2009SZ005）
陳晶（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称贩治鰴z測。E-mail：jingchen2015@sina.cn
張宏（1965—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物開發(fā)與應(yīng)用。E-mail：zhanghong651@aliyun.com
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陳 晶，李 琪，黃春萍，張曉峰，徐 艷，丁 然，張 宏，3，*
（1.四川師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610068；2.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101；3.四川師范大學(xué)植物資源應(yīng)用與開發(fā)研究所，四川 成都 610101）
枇杷花總黃酮、總?cè)频拇罂讟渲苽涔に?/p>
陳 晶1，李 琪2，黃春萍2，張曉峰2，徐 艷2，丁 然2，張 宏2，3，*
（1.四川師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610068；2.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101；3.四川師范大學(xué)植物資源應(yīng)用與開發(fā)研究所，四川 成都 610101）
以枇杷花中總黃酮、總?cè)坪孔鳛闄z測指標(biāo)，考察D101、AB-8、聚酰胺3 種大孔樹脂對枇杷花提取物中總黃酮、總?cè)频姆蛛x性能，考察4 種不同干燥方法對枇杷花總黃酮、總?cè)坪康挠绊憽＝Y(jié)果表明，大孔樹脂AB-8作為最佳分離樹脂，上樣量2.1 mL、吸附時(shí)間4 h、洗脫速率2 BV/h、洗脫體積3 BV時(shí)，枇杷花洗脫液中總黃酮含量為74.82%，收率為76.56%，總?cè)坪繛?5.57%，收率為46.48%；減壓干燥作為最佳干燥方法，真空度0.07 MPa、溫度45 ℃、干燥時(shí)間10 h時(shí)，純化物中總黃酮含量為76.07%，收率為77.87%，總?cè)坪繛?5.89%，收率為47.09%，含水量為4.07%。研究結(jié)果表明，此制備工藝可行，為枇杷花總黃酮、總?cè)频拈_發(fā)利用提供理論依據(jù)。
枇杷花；總黃酮；總?cè)?；分離純化；干燥
枇杷花作為我國的民間用藥，已有多年歷史。據(jù)相關(guān)資料記載，枇杷花性溫和而不燥、驅(qū)寒化痰，有溫肺、止咳、祛痰之功效，對感冒、咳嗽等疾病有著顯著的療效［1-3］。據(jù)文獻(xiàn)［4-7］報(bào)道，枇杷花中的主要化學(xué)成分有黃酮類、三萜類、多酚類、有機(jī)酸以及揮發(fā)性成分等。由于其具有多種生物活性成分，可以用于治療多種疾病，包括鎮(zhèn)咳、抗炎、抗腫瘤、糖尿病等［8-12］。經(jīng)研究［13-16］發(fā)現(xiàn)，枇杷花的止咳祛痰效果起顯著作用的是黃酮類和三萜類化合物。
近年來，采用大孔樹脂分離純化總黃酮、總?cè)频难芯浚?7-21］越來越多。丁然等［22］考察了D-101、D-160、AB-8、NKA-9和聚酰胺5 種吸附樹脂對枇杷花總黃酮的吸附與解吸附性能，篩選出性能較好的AB-8用于枇杷花提取物中總黃酮的分離純化；楊曉艷等［23］通過研究發(fā)現(xiàn)AB-8大孔樹脂適于分離純化莢果蕨總?cè)疲谧顑?yōu)條件下總?cè)苹厥章蕿?6.27%，純化倍數(shù)為2.88，但是少有同時(shí)分離純化枇杷花中總黃酮、總?cè)频难芯?。本?shí)驗(yàn)篩選擇了3 種常見的吸附樹脂，并通過對洗脫溶劑、洗脫速率、吸附時(shí)間等因素的考察，確定了枇杷花總黃酮、總?cè)频募兓に嚕豢疾炝? 種干燥方法對枇杷花總黃酮、總?cè)坪康挠绊?，確定了最優(yōu)干燥條件。本實(shí)驗(yàn)使用大孔樹脂對枇杷花中總黃酮和總?cè)苾深惢衔锿瑫r(shí)進(jìn)行分離純化，并對枇杷花分離純化物進(jìn)行干燥方法研究，為枇杷花的后期研究提供一定的理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
枇杷花2010年10月采于四川攀枝花，經(jīng)烘箱80 ℃烘干、粉碎后備用。
熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所；D-101大孔吸附樹脂（純凈級） 山東魯抗立科藥業(yè)有限公司；AB-8、聚酰胺樹脂（純凈級） 滄州寶恩吸附材料科技有限公司；95%乙醇（食品級）、其余試劑（均為分析純） 成都市科龍化工試劑廠。
1.2儀器與設(shè)備
UV-1700紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；BP211D十萬分之一天平 德國Sartoo-Rius公司；Ad Vantage冷凍干燥儀 美國Vir Tis公司；B-290噴霧干燥儀 瑞士Büchi公司。
1.3方法
1.3.1枇杷花提取物中總黃酮、總?cè)坪康臏y定
1.3.1.1供試品溶液制備
精密稱取枇杷花300 g，按照固液比1∶10加入50%乙醇溶液，在提取溫度80 ℃、提取時(shí)間2 h的條件下，回流提取2次，抽濾，合并濾液，減壓濃縮至一定量后定容于50 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻即得。
1.3.1.2枇杷花提取物中總黃酮、總?cè)茦?biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
精密稱取蘆丁對照品10.88 mg、熊果酸對照品11.19 mg，分別用50%乙醇溶液定容于50 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為217.6 mg/L和223.8 mg/L的對照品溶液。參考文獻(xiàn)［24-25］繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得蘆丁線性方程：Y=0.011 72A-0.004 65，R2=0.999 9，線性范圍為2.176～108.8 mg/L；熊果酸線性方程Y=0.011 37A-0.062 18，R2=0.999 9，線性范圍為22.3～223.8 mg/L。其中Y代表質(zhì)量濃度，A代表吸光度。
1.3.1.3樣品測定
精密移取枇杷花提取液1.0 mL至50 mL容量瓶中，用50%乙醇溶液稀釋至刻度，取1 mL稀釋液按1.3.1.2節(jié)方法測定吸光度，根據(jù)線性方程計(jì)算總黃酮、總?cè)频馁|(zhì)量濃度。
1.3.1.4總黃酮和總?cè)坪康挠?jì)算
枇杷花提取液中總黃酮的含量（W1）為：
枇杷花提取液中總?cè)频暮浚╓2）為：
枇杷花純化物中總黃酮的含量（W1′）為：
枇杷花純化物中總?cè)频暮浚╓2′）為：
枇杷花純化物中總黃酮的收率（S1）為：
枇杷花純化物中總?cè)频氖章剩⊿2）為：
式（1）～（6）中：Y1、Y2為枇杷花提取液的總黃酮、總?cè)瀑|(zhì)量濃度/（mg/L），D1、D2為提取液體積/L；M為原材料質(zhì)量/g；Y1′、Y2′為枇杷花純化物的總黃酮、總?cè)瀑|(zhì)量濃度/（mg/L），D1′、D2′為純化液體積/L；M′為純化物質(zhì)量/g；m1、m2為枇杷花純化物中總黃酮、總?cè)频馁|(zhì)量/g；m1′、m2′為用于分離純化的枇杷花提取物中總黃酮、總?cè)频馁|(zhì)量/g。
1.3.2吸附樹脂的預(yù)處理
表1 3 種大孔樹脂的物理性能Table 1 Physical properties of three macroporous resins
取3 種型號的吸附樹脂D-101、AB-8、聚酰胺（物理性能見表1），用95%乙醇溶液浸泡24 h后裝柱，用蒸餾水沖洗樹脂至流出液澄清且不再含有乙醇。依次以2 BV/h的速率用5%鹽酸溶液、5%氫氧化鈉溶液沖洗樹脂，直至流出液呈中性后用95%乙醇溶液浸泡備用。
1.3.3大孔吸附樹脂的篩選
將預(yù)處理好的D-101、AB-8、聚酰胺3 種吸附樹脂分別裝入柱體積為90 mL的玻璃層析柱。先用蒸餾水洗脫樹脂直至流出液澄清，再準(zhǔn)確移取1.7 mL枇杷花提取物溶液上樣，依次用蒸餾水、95%乙醇溶液洗脫樣品。按1.3.1節(jié)方法測定各洗脫片段中總黃酮、總?cè)频暮坎⒂?jì)算收率。
1.3.4洗脫溶劑對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊?/p>
準(zhǔn)確移取1.7 mL枇杷花提取物溶液上樣AB-8大孔樹脂層析柱后，控制洗脫速率為2 BV/h（2 BV為2 倍柱體積），依次用蒸餾水、50%乙醇溶液、95%乙醇溶液洗脫樣品，每個(gè)片段洗脫4 BV，分別收集3 個(gè)洗脫片段。各洗脫片段經(jīng)減壓濃縮后放入60 ℃烘箱干燥。按1.3.1節(jié)方法測定各洗脫片段中總黃酮、總?cè)频暮坎⒂?jì)算收率。
1.3.5枇杷花提取物中總黃酮、總?cè)萍兓に噧?yōu)化
1.3.5.1單因素試驗(yàn)
1）上樣量對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊懀簻?zhǔn)確移取枇杷花提取物溶液0.8、1.2、1.7、2.1、2.9、3.8 mL，分別上樣AB-8大孔樹脂層析柱，吸附4 h后，按1.3.4節(jié)方法進(jìn)行洗脫，收集50%乙醇溶液洗脫片段，經(jīng)減壓濃縮后放入60 ℃烘箱內(nèi)干燥。按1.3.1節(jié)方法測定50%洗脫片段中總黃酮、總?cè)频暮坎⒂?jì)算收率。2）洗脫速率對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊懀簻?zhǔn)確移取枇杷花提取物溶液2.1 mL上樣AB-8大孔樹脂層析柱，吸附4 h后，控制洗脫速率分別為0.5、2、4 BV/h，按1.3.4節(jié)方法進(jìn)行洗脫，后續(xù)操作同上。3）吸附時(shí)間對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊懀簻?zhǔn)確移取枇杷花提取物溶液2.1 mL上樣AB-8大孔樹脂層析柱，分別吸附樣品2、4、8、16、24 h后，按1.3.4節(jié)方法進(jìn)行洗脫，后續(xù)操作同上。4）洗脫體積對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊懀簻?zhǔn)確移取枇杷花提取物溶液2.1 mL上樣AB-8大孔樹脂層析柱，吸附4 h后，按1.3.4節(jié)方法進(jìn)行洗脫，各片段分別洗脫2、3、4、5、6 BV，后續(xù)操作同上。
1.3.5.2正交試驗(yàn)
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取上樣量、洗脫速率、吸附時(shí)間、洗脫體積4 個(gè)因素，每個(gè)因素考察3 個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以50%乙醇溶液洗脫片段中總黃酮收率作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。正交試驗(yàn)因素水平見表2。
表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels used in orthogonal array design
1.3.5.3最佳純化工藝條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
按1.3.5.2節(jié)所確定的最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（n=3）。按1.3.1節(jié)方法測定50%乙醇溶液洗脫片段中總黃酮、總?cè)频暮坎⒂?jì)算收率。
1.3.6枇杷花純化物的干燥工藝
按1.3.5節(jié)所確定的純化條件對枇杷花提取物進(jìn)行分離純化，收集50%乙醇溶液洗脫片段，減壓濃縮至浸膏。精確量取浸膏50 mL作為一個(gè)待測樣品。分別進(jìn)行不同方式的干燥：常壓干燥，溫度設(shè)定為40、60、80 ℃；減壓干燥，真空度設(shè)定為0.07 MPa，溫度為45、55、65 ℃；冷凍干燥，升華溫度設(shè)為30、40、50 ℃；噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為120、140、160、180 ℃，霧化器轉(zhuǎn)速28 000 r/min，流量為0.9 mL/min。收集干粉，稱質(zhì)量。記錄干燥至固體狀態(tài)所需時(shí)間，按1.3.1節(jié)方法測定樣品中總黃酮、總?cè)频暮坎⒂?jì)算收率。
2 結(jié)果與分析
2.1提取溶劑體積分?jǐn)?shù)對枇杷花總黃酮、總?cè)坪康挠绊?/p>
總黃酮、總?cè)频臉O性有一定的差異，為了同時(shí)提取枇杷花中的總黃酮、總?cè)?，本?shí)驗(yàn)考察了兩種不同的提取方法，即50%乙醇溶液提取2 次和50%、95%乙醇溶液分別提取1 次。由表3可知，50%乙醇提取物中枇杷花總黃酮的含量明顯較高，而總?cè)频暮縿t略低于混合95%、50%乙醇溶液提取物。因此本實(shí)驗(yàn)選取50%乙醇溶液作為樣品的提取溶劑。
表3 提取溶劑體積分?jǐn)?shù)對枇杷花提取物中總黃酮、總?cè)坪康挠绊慣able 3 Effect of extraction solvents on the contents of flfl avonoids and triterpene
表3 提取溶劑體積分?jǐn)?shù)對枇杷花提取物中總黃酮、總?cè)坪康挠绊慣able 3 Effect of extraction solvents on the contents of flfl avonoids and triterpene
提取溶劑50%乙醇溶液95%乙醇溶液和50%乙醇溶液總黃酮含量20.36±0.33516.76±0.344總?cè)坪?.867±0.3017.403±0.340
2.23 種吸附樹脂對枇杷花總黃酮、總?cè)频募兓Ч?/p>
表4 3 種樹脂對總黃酮、總?cè)频姆蛛x純化效果Table 4 Effect of three resins on separation and purififi cation of flfl avonoids and triterpenoi
表4 3 種樹脂對總黃酮、總?cè)频姆蛛x純化效果Table 4 Effect of three resins on separation and purififi cation of flfl avonoids and triterpenoi
D-101AB-8聚酰胺總黃酮含量水洗脫片段3.682±1.3114.113±1.1231.020±1.421 95%乙醇洗脫片段50.67±0.21555.01±0.21128.97±0.652總黃酮收率各洗脫片段收率之和56.70±0.41758.21±0.52332.89±0.313總?cè)坪克疵撈?.265±2.2371.312±1.3340.724±2.533 95%乙醇洗脫片段18.16±0.14518.37±0.1128.712±0.421總?cè)剖章矢飨疵撈问章手?4.69±0.20446.43±0.19313.58±0.501
由表4可知，3 種樹脂分離純化枇杷花總黃酮、總?cè)频哪芰Υ笮№樞驗(yàn)锳B-8＞D-101＞聚酰胺。聚酰胺樹脂由于極性較大，吸附性能強(qiáng)而解吸性能較弱，樣品很難從樹脂上洗脫下來。D-101大孔樹脂在吸附及解吸性能上略低于AB-8大孔樹脂，所以選擇AB-8大孔樹脂作為吸附材料。
2.3洗脫方法對枇杷花總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊?/p>
5 各洗脫片段的總黃酮、總?cè)坪考笆章剩▁ =3）Table 5 Contents and yields of flfl avonoids and triterpenes in the eluted fractions （x ± ， = 3）
5 各洗脫片段的總黃酮、總?cè)坪考笆章剩▁ =3）Table 5 Contents and yields of flfl avonoids and triterpenes in the eluted fractions （x ± ， = 3）
%方法1方法2水洗脫片段95%乙醇溶液95%乙醇溶液洗脫片段總黃酮含量4.295±1.11053.51±1.0113.872±1.01369.11±0.431 7.072±1.231總黃酮收率57.43±0.23175.21±0.211總?cè)坪?.197±1.002 18.84±1.6711.059±1.241 15.14±0.321 4.213±1.523總?cè)剖章?6.22±1.02145.27±1.101洗脫片段水洗脫片段50%乙醇溶液洗脫片段
由表5可知，50%乙醇溶液洗脫片段的總黃酮含量及收率遠(yuǎn)高于方法1中95%乙醇洗脫片段，總?cè)坪考笆章蕜t略低?？紤]到總黃酮在枇杷花中的含量高于總?cè)疲?0%乙醇溶液洗脫片段既能得到較高的總黃酮含量及收率，也能滿足總?cè)坪考笆章实囊?。因此選用洗脫方法2對枇杷花提取物進(jìn)行純化，洗脫片段分為水洗脫片段、50%乙醇溶液洗脫片段、95%乙醇洗脫片段。從表5可以看出，方法2中水洗脫片段、95%乙醇洗脫片段得到的總黃酮總?cè)坪烤^低，對收率的影響很小，因此用50%乙醇溶液洗脫片段中總黃酮、總?cè)频暮考笆章首鳛楹罄m(xù)實(shí)驗(yàn)的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。
2.4AB-8大孔樹脂分離純化枇杷花總黃酮、總?cè)圃囼?yàn)優(yōu)化
2.4.1單因素試驗(yàn)結(jié)果
2.4.1.1上樣量的選擇
圖1 上樣量對總黃酮、總?cè)坪亢褪章实挠绊慒ig.1 Effect of sample volume on the contents of fl avonoids and triterpenes and their yields
由圖1可以看出，上樣量對枇杷花提取物中總黃酮、總?cè)坪考笆章视酗@著影響。隨著上樣量的增加，樣品中總黃酮、總?cè)频暮亢褪章室仓饾u增加。當(dāng)上樣量為2.1 mL時(shí)，樣品中總黃酮、總?cè)频暮考笆章识歼_(dá)到最大值。當(dāng)上樣量繼續(xù)增加時(shí)，樣品的純度及收率都大大降低，開始出現(xiàn)泄漏趨勢。2.1 mL是樹脂的最大承載量，因此初步選擇2.1 mL為最佳上樣量。
2.4.1.2洗脫速率的選擇
圖2 洗脫速率對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊慒ig.2 Effect of elution fl ow rate on the contents of fl avonoids and triterpenes and their yields
如圖2所示，當(dāng)洗脫速率為0.5 BV/h時(shí)，總黃酮、總?cè)坪考笆章示愿哂谙疵撍俾? BV/h，但是2 BV/h的洗脫速率可以減少洗脫時(shí)間，提高洗脫效率。因此選擇洗脫速率為2 BV/h。
2.4.1.3吸附時(shí)間的選擇
圖3 吸附時(shí)間對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊慒ig.3 Effect of adsorption time on the contents of fl avonoids and triterpenes and their yields
由圖3可以看出，總黃酮、總?cè)坪考笆章氏入S著吸附時(shí)間的延長而增加，當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)到4 h時(shí)，樹脂達(dá)到飽和狀態(tài)，含量及收率達(dá)到最大值。隨著吸附時(shí)間的延長，總黃酮、總?cè)坪考笆章蕩缀醪辉僮兓?。因此選擇吸附時(shí)間為4 h。
2.4.1.4洗脫體積的選擇
圖4 洗脫體積對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊慒ig.4 Effect of elution volume on the contents of fl avonoids and triterpenes and their yields
由圖4可以看出，總黃酮及總?cè)频暮考笆章孰S著洗脫體積的增加而增加。當(dāng)洗脫體積達(dá)到3、4 BV時(shí)，總黃酮、總?cè)坪考笆章示^高。隨著洗脫體積的增加，總黃酮、總?cè)坪考笆章食氏陆第厔荩@是因?yàn)橄疵撓聛淼碾s質(zhì)的含量增加導(dǎo)致的。當(dāng)洗脫體積為3 BV和4 BV時(shí)，總黃酮、總?cè)坪考笆章蕩缀跸嗤紤]到減少洗脫劑用量，減少成本，故選擇洗脫體積為3 BV。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果可知：影響AB-8大孔樹脂分離純化性能的因素有上樣量、洗脫速率、吸附時(shí)間和洗脫體積；且根據(jù)純化后總黃酮和總?cè)坪考笆章实淖兓醪秸J(rèn)為各因素對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊憺椋荷蠘恿浚鞠疵撍俾剩鞠疵擉w積＞吸附時(shí)間。
2.4.2正交試驗(yàn)結(jié)果
表6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Results of orthogonal array design
由表6可知，各因素對枇杷花提取物總黃酮收率影響的大小為：上樣量＞洗脫速率＞洗脫體積＞吸附時(shí)間，其中上樣量對總黃酮收率的影響最大，吸附時(shí)間對總黃酮收率的影響最小。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，最佳優(yōu)選工藝組合是A2B1C2D2，即上樣量2.1 mL、洗脫速率0.5 BV/h、吸附時(shí)間4 h、洗脫體積3 BV。根據(jù)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，洗脫速率為0.5 BV/h和2 BV/h時(shí)，總黃酮收率相近，而0.5 BV/h的洗脫速率較慢，影響工作效率，不適宜工業(yè)化生產(chǎn)。故最終選擇工藝組合是A2B2C2D2。正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見表7。
表7 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 7 Analysis of variance for the orthogonal array design
2.4.3樹脂最佳工藝條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
按1.3.5.2節(jié)所確定的最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（n=3），測得枇杷花提取物的50%乙醇溶液洗脫片段中總黃酮的含量為74.82%，收率為76.56%，總?cè)频暮繛?5.57%，收率為46.48%，其總黃酮和總?cè)频暮亢褪章示^高。結(jié)果表明，正交試驗(yàn)所得工藝條件最優(yōu)。
2.5枇杷花純化物干燥工藝
2.5.1常壓干燥溫度的選擇
表8 常壓干燥溫度對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊慣able 8 Effect of atmospheric drying temperature on the contents of fl avonoids and triterpenes and their yields
由表8可知，當(dāng)烘箱溫度為40 ℃和60 ℃時(shí)，總黃酮、總?cè)坪亢褪章氏嘟?，?dāng)溫度為80℃時(shí)，總黃酮、總?cè)频暮棵黠@降低，這是因?yàn)闇囟冗^高，樣品的有效成分遭到部分破壞。40 ℃時(shí)的含量和收率略低于60 ℃，干燥耗時(shí)較長。從干燥后樣品的含水量來看，當(dāng)干燥溫度為60、80 ℃時(shí)，含水量相近且比溫度為40 ℃時(shí)較低。綜合有效物質(zhì)的含量及收率、干燥耗時(shí)及含水量，選擇60 ℃作為常壓干燥的最佳溫度。
2.5.2減壓干燥條件的選擇
表9 減壓干燥溫度總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊慣able 9 Effect of vacuum drying temperature on the contents and yields of fl avonoids and triterpenes
由表9可以看出，在不同干燥溫度條件下，樣品干燥后含水量相當(dāng)。當(dāng)干燥溫度為45 ℃時(shí)，枇杷花總黃酮、總?cè)坪?、收率均較高。因此選擇干燥溫度為45 ℃。
2.5.3冷凍干燥條件的選擇
表10 真空冷凍干燥升華溫度總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊慣able 10 Effect of sublimation temperature of freeze-drying on the contents of fl avonoids and triterpenes and their yields
由表10可以看出，當(dāng)升華溫度為30、40 ℃時(shí)，枇杷花總黃酮和總?cè)坪俊⑹章始案稍锖髽悠返暮烤喈?dāng)，但用40 ℃進(jìn)行干燥時(shí)，可以縮短干燥時(shí)間；當(dāng)溫度升高至50 ℃時(shí)，對縮短凍干時(shí)間沒有實(shí)質(zhì)性影響，反而降低了總黃酮和總?cè)频暮亢褪章?。因此?shí)驗(yàn)確定升華溫度為40 ℃。
2.5.4噴霧干燥條件的選擇噴霧干燥耗時(shí)均約為1 h，由表11可以看出，干燥后樣品的含水量隨進(jìn)風(fēng)溫度的增加而降低，但下降趨勢隨進(jìn)風(fēng)溫度升高而減弱。當(dāng)進(jìn)風(fēng)溫度低于140 ℃時(shí)，有部分樣品在噴霧塔內(nèi)壁附著，所得樣品含水量比較大。當(dāng)進(jìn)風(fēng)溫度超過180 ℃時(shí)，樣品含水量雖然較小，但卻造成枇杷花止咳有效成分的損失，因此進(jìn)風(fēng)溫度不宜太高。確定進(jìn)風(fēng)溫度為160 ℃，出風(fēng)溫度為80 ℃時(shí)，產(chǎn)品質(zhì)量較高。
表11 噴霧干燥進(jìn)風(fēng)溫度對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊慣able 11 Effect of inlet temperature of spray drying on the contents of fl avonoids and triterpenes and their yields
2.5.54 種干燥方法的綜合比較
表12 干燥方法對總黃酮、總?cè)坪考笆章实挠绊慣able 12 Effect of different drying methods on the contents of fl avonoids and triterpenes and their yields
為比較4 種干燥方法的優(yōu)劣，各取其最佳條件來進(jìn)行比較，結(jié)果見表12。根據(jù)樣品中總黃酮、總?cè)坪?、收率以及樣品含水量來比較4 種干燥方法的干燥效果，冷凍干燥的效果最好，減壓干燥次之。噴霧干燥的效果較常壓干燥要好。冷凍干燥時(shí)由于低溫條件下各種化學(xué)反應(yīng)的速率低，樣品有效成分也不易遭到破壞。就干燥耗時(shí)而言，噴霧干燥耗時(shí)最短。減壓干燥使水的沸點(diǎn)降低，傳熱溫差增大，傳熱效率提高，達(dá)到相同干燥程度時(shí)，減壓干燥比常壓干燥所需時(shí)間少。冷凍干燥過程較其他幾種干燥方法復(fù)雜，所需干燥時(shí)間最長。經(jīng)冷凍干燥后樣品中有效成分的品質(zhì)最好，但該法需要的干燥條件較為苛刻，且設(shè)備昂貴，周期長，成本高?？紤]到后續(xù)實(shí)驗(yàn)，選擇減壓干燥作為干燥枇杷花總黃酮、總?cè)频姆椒ā?/p>
3 結(jié) 論
本實(shí)驗(yàn)對枇杷花中有效成分的制備工藝進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AB-8大孔樹脂比較適合于枇杷花中有效成分的分離純化，純化工藝參數(shù)為上樣量2.1 mL、洗脫速率2 BV/h、吸附時(shí)間4 h、洗脫體積3 BV，在此條件下得到的總黃酮含量為74.82%，收率為76.56%，總?cè)坪繛?5.57%，收率為46.48%；減壓干燥適用于干燥枇杷花中總黃酮、總?cè)?，干燥條件為真空度0.07 MPa、溫度45 ℃、干燥耗時(shí)10 h，所得樣品總黃酮含量為76.07%，收率為77.87%，總?cè)坪繛?5.89%，收率為47.09%，含水量為4.07%。
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Preparation of Flavonoids and Triterpenoids from Flowers of Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl by Macroporous Resins
CHEN Jing1， LI Qi2， HUANG Chunping2， ZHANG Xiaofeng2， XU Yan2， DING Ran2， ZHANG Hong2，3，*
（1. College of Chemistry and Materials Science， Sichuan Normal University， Chengdu 610068， China；2. College of Life Sciences， Sichuan Normal University， Chengdu 610101， China；
3. Institute of Application and Development of Plant Resources， Sichuan Normal University， Chengdu 610101， China）
The total fl avonoids and triterpenoids of loquat fl ower extracts were purifi ed with D101， AB-8 and polyamide resins and dried by atmospheric drying， vacuum drying， freeze drying and spray drying， respectively. The effectiveness of these methods was tested based on the content and yield of total fl avonoids and triterpenoids. The results showed that AB-8 was the best macroporous resin for the separation and purifi cation of fl avonoids and triterpenoids， and vacuum drying was the best drying method. The optimal conditions for purifi cation were determined as follows： sample volume， 2.1 mL；elution fl ow rate， 2 BV/h； adsorption time， 4 h； and eluent volume， 3 BV. Under these conditions， the content and yield of fl avonoids were 74.82% and 76.56% and the content and yield of triterpenoids were 15.57% and 46.48%， respectively. The optimal conditions for vacuum drying were obtained by 10 h drying at 45 ℃ with a vacuum degree of 0.07 MPa. Under the optimized drying conditions， fl avonoids content was 76.07% with a yield of 77.87%， triterpenoids content was 15.89% with a yield of 47.09% and moisture content was 4.07%.
loquat fl owers； fl avonoids； triterpenoids； separation and purifi cation； drying
R284.2
A
1002-6630（2015）18-0058-06
10.7506/spkx1002-6630-201518010
2015-01-29
四川省科技廳第三批應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目（2009SZ005）
陳晶（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称贩治鰴z測。E-mail：jingchen2015@sina.cn
張宏（1965—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物開發(fā)與應(yīng)用。E-mail：zhanghong651@aliyun.com
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