陳 軍， 武延慶， 姚 莉

（蘭州大學第二醫(yī)院藥學部，甘肅　蘭州　730030）

艾迪注射液對肺癌SPC-A-1細胞的增殖抑制作用及其機制

陳 軍， 武延慶， 姚 莉*

（蘭州大學第二醫(yī)院藥學部，甘肅蘭州730030）

目的 研究艾迪注射液對肺癌SPC-A-1細胞增殖的影響，并探討其作用機制。方法 采用巰基羅丹明B（SRB）法檢測艾迪注射液對肺癌SPC-A-1細胞的抑制率，流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡，Hoechst33258熒光染色法觀察細胞核形態(tài)的變化，免疫印跡法（Western blot）檢測ERK1/2磷酸化，caspase-9及caspase-3的表達。結(jié)果 艾迪注射液作用24 h和48 h均對肺癌SPC-A-1細胞增殖具有顯著的抑制作用（P＜0.01，P＜0.001）；與對照組相比，艾迪注射液作用48 h后G2/M期細胞比例增加（P＜0.001），G0/G1期和S期細胞比例下降（P＜0.01，P＜0.05），細胞凋亡率升高（P＜0.01）；同時細胞中ERK1/2磷酸化水平降低（P＜0.01），caspase-9及caspase-3表達增強（P＜0.05，P＜0.05）。結(jié)論 艾迪注射液能夠通過阻滯細胞G2/M期和誘導凋亡作用抑制肺癌SPC-A-1細胞增殖，其機制與降低ERK1/2磷酸化水平和增加caspases-9及caspase-3活性有關(guān)。

艾迪注射液；SPC-A-1；周期；凋亡；ERK1/2；caspase

艾迪注射液是由斑蝥、人參、黃芪及刺五加提取制成的抗腫瘤中藥注射液，目前已廣泛用于原發(fā)性肝癌，肺癌，消化道腫瘤及婦科惡性腫瘤等的治療［1-3］。體外研究顯示，它對多種腫瘤細胞具有增殖抑制作用［4-7］，但尚未見艾迪注射液對肺癌SPC-A-1細胞作用的報道，本實驗旨在觀察艾迪注射液對肺癌SPC-A-1細胞增殖的影響，并對其機制進行初步探討。

1　材料與方法

1.1細胞系 人肺癌SPC-A-1細胞購自中科院細胞庫（上海），采用含有10%優(yōu)級胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃。

1.2藥品及試劑 艾迪注射液（批號20130317，貴州益佰制藥股份有限公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司）；巰基羅丹明B蛋白染料（SRB，美國Sigma公司）；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒及細胞凋亡熒光Hoechst33258檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限責任公司；Phospho-p44/42 MAPK（ERK1/2）rabbitmAb（美國Cell Signaling公司）；caspase-9及caspase-3抗體（美國Santa Cruz公司）；β-Actin（美國Sigma公司）。

1.3儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（美國SIM公司）；尼康80i熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；Spectra Mr型全波長酶標儀（美國DYNEX公司）；FACSCalibur型流式細胞儀（美國BD公司）。

1.4方法

1.4.1SRB法檢測SPC-A-1細胞增殖抑制率 實驗分艾迪注射液處理組和對照組，根據(jù)文獻［8］選用艾迪注射液質(zhì)量濃度依次為10、20、40、80、100 mg/mL，每組設3個復孔。取對數(shù)生長期SPC-A-1細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋為單細胞懸液，并以8×103個/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中。24 h后艾迪注射液處理組分別加入經(jīng)培養(yǎng)基稀釋成不同質(zhì)量濃度的艾迪注射液；對照組則加入等體積的培養(yǎng)基。5% CO2，37℃孵育24 h或48 h后每孔加入預冷的50%TCA溶液50μL，4℃固定1 h，去離子水洗滌5次，晾干；每個孔加0.4%SRB染色液50μL，常溫下避光染色10～15 min，1%冰醋酸溶液洗滌5次，晾干，加入150μL 10 mmol/L的非緩沖Tris堿溶液，振搖溶解并混勻。酶標儀515 nm波長處測定吸光度（OD）值并計算各組的增殖抑制率。所有試驗均重復4次。

1.4.2流式細胞術(shù)檢測SPC-A-1細胞周期和凋亡 實驗分為對照組，艾迪高質(zhì)量濃度組（100 mg/mL），中質(zhì)量濃度組（50 mg/mL）和低質(zhì)量濃度組（10 mg/mL）。取對數(shù)生長期SPC-A-1細胞接種于6孔板中，5%CO2，37℃孵育48 h后，消化細胞，吹打成單細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，預冷的PBS洗滌2次，根據(jù)細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒操作說明書采用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡。

1.4.3Hoechst33258熒光染色法觀察細胞核的變化 實驗分組同“1.4.2”項。取對數(shù)生長期SPC-A-1細胞接種于6孔板中，5%CO2，37℃孵育48 h，收集細胞并制成合適濃度的細胞懸液，根據(jù)Hoechst 33258熒光染色說明書進行染色，并在熒光顯微鏡下觀察細胞核的形態(tài)和熒光的強弱，采集圖像。該方法觀察細胞凋亡時，正常細胞核呈微弱的藍色熒光，凋亡細胞則呈明亮藍光，并伴有細胞核呈碎塊狀致密濃染。

1.4.4Western blot檢測ERK1/2磷酸化，caspase-9及caspase-3的表達 實驗分組同“1.4.2”項。取對數(shù)生長期的SPC-A-1細胞接種于6孔板中，藥物作用48 h，棄去6孔板中舊的培養(yǎng)液，后加入適量RIPA細胞裂解液（含4%蛋白酶抑制劑和10%磷酸酶抑制劑）冰上裂解30min，離心（12 000 r/min，4℃）15 min，取上清。BCA法對樣品中總蛋白進行定量，規(guī)定上樣量為30μg。p-ERK1/2抗體1∶1 000稀釋，caspase-9和caspase-3抗體1∶500稀釋，4℃過夜，加入二抗（1∶1 000稀釋）室溫孵育2 h，ECL法顯色。采用軟件Image pro plus V 7.0分析條帶的積分光密度。

2　結(jié)果

2.1艾迪注射液對SPC-A-1肺癌細胞的增殖抑制作用 從表1中可以看到，加入藥物作用24、48 h后，不同質(zhì)量濃度的艾迪注射液均對SPC-A-1肺癌細胞的增殖有顯著的抑制作用（P＜0.01，P＜0.01），并且呈明顯的時間和質(zhì)量濃度依賴性（P＜0.05，P＜0.05），兩者之間沒有交互作用（P＞0.05），即表明艾迪注射對SPC-A-1肺癌細胞的作用時間和作用質(zhì)量濃度兩者之間沒有協(xié)同效應。艾迪注射液作用24 h的IC50值是78.47 mg/mL，48 h的IC50值是63.23 mg/mL。

表1　艾迪注射液對肺癌SPC-A-1細胞增殖的影響（±s，n=4）

表1　艾迪注射液對肺癌SPC-A-1細胞增殖的影響（±s，n=4）

與對照組比較，*P＜0.01，**P＜0.01，***P＜0.001

組別抑制率/% 24 h 48 h對照組00艾迪10 mg/mL組8.24±0.68 14.30±3.01*艾迪20 mg/mL組16.90±4.47 25.35±5.57**艾迪40 mg/mL組39.09±3.21**42.01±11.21**艾迪80 mg/mL組46.90±8.44***51.31±14.01***艾迪100 mg/mL組56.33±10.07***62.50±9.87***

2.2艾迪注射液對SPC-A-1細胞周期和凋亡率的影響 如表2所示，艾迪注射液作用48 h后，與對照組比較，G0/ G1期、S期細胞比例下降（P＜0.01，P＜0.05），G2/M期細胞比例增加（P＜0.001），細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01），表明艾迪注射液可將SPC-A-1細胞周期阻滯于G2/ M期并誘導期產(chǎn)生凋亡效應。

表2　艾迪注射液對SPC-A-1細胞周期和凋亡率的影響（±s，n=4）

表2　艾迪注射液對SPC-A-1細胞周期和凋亡率的影響（±s，n=4）

注：與對照組比較，*P＜0.01，**P＜0.01，***P＜0.001

組 別細胞周期/% G0/G1S G2/M凋亡率/%對照組50.53±0.86 31.62±0.47 17.88±0.47 9.25±1.56艾迪10 mg/mL組47.50±0.79**30.49±1.05 22.02±1.95***24.64±0.90**艾迪50 mg/mL組47.05±0.45***29.52±1.14*23.46±0.84***28.70±2.20**艾迪100 mg/mL組45.98±0.84***28.95±1.24*25.12±0.57***30.24±0.66**

2.3艾迪注射液對SPC-A-1細胞核形態(tài)的影響 如圖1所示，經(jīng)Hoechst33258熒光染色后，對照組的細胞核呈正常均勻微弱的藍色熒光，艾迪注射液處理組細胞則呈明亮藍光，并伴有細胞核破碎致密濃染。并且隨著艾迪注射液質(zhì)量濃度的增加，細胞核藍色熒光逐漸增強，并且細胞核破碎也更加明顯。

2.4艾迪注射液對SPC-A-1細胞ERK1/2磷酸化，caspase-9及caspase-3表達的影響 如圖2所示，不同質(zhì)量濃度的艾迪注射液作用48 h后，和對照組相比，SPC-A-1細胞中ERK1/2蛋白磷酸化水平顯著下降（P＜0.01），并呈濃度依賴性。50 mg/mL和100 mg/mL艾迪注射液作用48 h后，SPC-A-1細胞中caspase-9，caspase-3蛋白表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.05），但10 mg/mL艾迪注射液對caspase-9和caspase-3的表達均沒有明顯影響（P＞0.05）。

3　討論

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，對其的治療一直備受關(guān)注［9］。艾迪注射液作為一種復方抗腫瘤中藥制劑已廣泛用于臨床，尤其是用于肺癌的治療已取得良好效果。大量臨床報道顯示［10-15］，艾迪注射液單獨使用或聯(lián)合放化療對多種肺癌起到治療或放化療增效作用。體外研究顯示，艾迪注射液能夠通過多種機制抑制多種肺癌細胞增殖從而發(fā)揮其抗肺癌作用［4-7］。

本實驗觀察了艾迪注射液對肺癌SPC-A-1細胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)艾迪注射液對肺癌SPC-A-1細胞的增殖具有顯著的抑制作用，同時，對其作用機制進行了研究，流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，艾迪注射液能夠明顯誘導SPC-A-1細胞G2/M期阻滯并引起細胞凋亡率升高。眾所周知，細胞周期G2/M期轉(zhuǎn)換在細胞周期進展及凋亡啟動中扮演著非常重要的作用。細胞在從G2期過渡至M期時需經(jīng)過G2期檢測點檢查DNA復制的完整性及正確性，若G2期DNA損傷檢查點的延遲增加，將直接誘導細胞凋亡［16］。因此，人們常通過G2/M期阻滯方法來促進細胞凋亡，而G2/M期阻滯已成為抗腫瘤藥物的主要研究方向之一。本課題組認為，SPC-A-1細胞凋亡率增加正是由于艾迪注射液對G2/M期的阻滯作用引起的。為了進一步證實艾迪注射液對SPCA-1細胞凋亡的影響，本實驗采用Hoechst 33258熒光染色實驗觀察艾迪注射液對SPC-A-1細胞核形態(tài)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)艾迪注射液能夠引起細胞核藍色熒光增強和細胞核破碎增加，這些結(jié)果與流式檢測結(jié)果相符，進一步說明艾迪注射液能誘導SPC-A-1細胞發(fā)生凋亡。

圖1　艾迪注射液對SPC-A-1細胞核形態(tài)的影響

圖2　艾迪注射液對SPC-A-1細胞ERK1/2磷酸化，caspase-9及caspase-3的表達的影響（±s，n=4）

細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）常以磷酸化的活化方式廣泛參與細胞的增殖、分化、細胞存活等多種生物化學反應，對腫瘤的發(fā)展、預防和治療等都有重要的作用［17］。本實驗觀察了艾迪注射液對ERK1/2磷酸化水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)艾迪注射液能夠下調(diào)SPC-A-1細胞ERK1/2磷酸化水平，這就提示艾迪注射液可能通過直接抑制ERK信號通路實現(xiàn)對SPC-A-1細胞的增殖抑制作用。半胱天冬氨酸蛋白酶（caspases）在細胞凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用。細胞凋亡的過程實際上是caspase不可逆有限水解底物的級聯(lián)放大反應過程，在人體細胞中，caspases的超表達和激活均可引起細胞的凋亡［18］。其中caspases-9和caspase-3被認為是caspase依賴凋亡途徑中最關(guān)鍵的兩個因子。一般認為caspases-9可與細胞色素形成復合物被激活并進一步激活細胞凋亡過程中最關(guān)鍵酶caspase-3從而觸發(fā)凋亡級聯(lián)反應［19］。結(jié)合本實驗結(jié)果，50～100 mg/mL艾迪注射液能劑量依賴性上調(diào)caspases-9及caspase-3的表達，因此，不妨認為艾迪注射液能夠通過調(diào)節(jié)caspases-9及caspase-3活性而誘導細胞凋亡。

通過干擾細胞周期進程抑制腫瘤細胞的增殖或（和）誘導腫瘤細胞凋亡是目前大多數(shù)腫瘤化療藥物發(fā)揮抗腫瘤作用的主要機制［20］。結(jié)合本研究結(jié)果，我們不妨認為艾迪注射液對SPC-A-1細胞的增殖抑制作用是通過阻滯細胞周期和誘導凋亡實現(xiàn)的，其機制可能與通過抑制ERK1/2蛋白磷酸化水平、上調(diào)caspases-9及caspase-3表達有關(guān)。該研究為艾迪注射液抗肺癌臨床應用提供了進一步的實驗依據(jù)。

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R285.5

B

1001-1528（2015）03-0630-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.037

2014-02-01

陳 軍（1969—），男，主管藥師。Tel：（0931）8942791，E-mail：lzuchenj@163.com

姚 莉（1971—），女，副主任藥師。Tel：（0931）8942407，E-mail：yaoli71@sina.com