張 寧, 岳玉林, 吳秀麗， 吳祿勇, 莫崢嶸, 司宏宗, 舒火明, 何文英*

(1.海南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，海南海口 571158；2.青島大學(xué)計(jì)算科學(xué)與工程技術(shù)研究中心，山東青島 266071；3.海南經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，海南?？?571127)

圖1 BPTA的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of BPTA

1,2,3-三氮唑化合物具有廣泛的生理活性,它易與生物體內(nèi)多種酶和受體結(jié)合,已經(jīng)被用于多肽、DNA、RNA和糖類等化合物結(jié)構(gòu)修飾中,并表現(xiàn)出良好的效果，在醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用而成為目前新藥研發(fā)的重點(diǎn)領(lǐng)域之一[1，2]。1-(4-溴苯基)-5-苯基-1H-1,2,3-三唑(1-(4-bromophenyl)-5-phenyl-1H-1,2,3-triazole,BPTA)(結(jié)構(gòu)見圖1)是新合成的一種三氮唑類化合物[3]，作為一種潛在開發(fā)利用的藥物小分子，系統(tǒng)研究它的抗菌活性及其與人體內(nèi)生物大分子的相互作用還未見報(bào)道。血清白蛋白由于在哺乳動(dòng)物體內(nèi)起著重要的貯存和運(yùn)輸作用,也是藥物的一種非常重要的運(yùn)輸載體，故常用作研究與藥物小分子相互作用的模型蛋白[4,5]。

本文在模擬生理?xiàng)l件下結(jié)合分子模擬、熒光偏振、同步及三維熒光等方法研究了BPTA與人血清白蛋白(HSA)的相互作用，確定了鍵合參數(shù)及作用力模式，定性分析了BPTA對HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)及微環(huán)境的影響。通過研究BPTA與HSA的相互作用及抗菌活性,不僅揭示了BPTA生物活性的新信息，而且對于設(shè)計(jì)BPTA類新藥，篩選相關(guān)藥物等都具有非常重要的指導(dǎo)意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-7000型熒光光度計(jì)(日本，日立公司)；RF-5301PC型熒光光度計(jì)(日本，島津公司)；TU-1901型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；BS124S電子天平(德國，賽多利斯)；pH-3S酸度計(jì)(上海精密儀器廠)。

BPTA(海南師范大學(xué)有機(jī)化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供,純度>99.9%，分子量為301)儲(chǔ)備液濃度1.70×10-3mol·L-1，用甲醇配制。三羥甲基氨基甲烷(Tris，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)-HCl緩沖溶液:用超純水溶解并用HCl調(diào)節(jié)pH至7.40,配制成濃度為0.05 mol·L-1的緩沖溶液。人血清白蛋白(HSA，上海伯奧生物科技有限公司)溶液用pH=7.40 Tris-HCl 緩沖溶液配制，儲(chǔ)備液濃度3.0×10-5mol·L-1，于 4 ℃暗處保存。其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1BPTA的結(jié)構(gòu)優(yōu)化及與HSA的分子模擬利用SYBYL7.3軟件獲得化合物的三維結(jié)構(gòu),再根據(jù)Tripos力場對各種最合理分子的起始構(gòu)象進(jìn)行能量優(yōu)化，以能量最低者(生成熱)為藥效構(gòu)象；用共軛梯度法進(jìn)一步優(yōu)化BPTA分子結(jié)構(gòu)。分子模擬步驟為：先從Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得HSA的晶體結(jié)構(gòu)(編號(hào)為1h9z),根據(jù)Tripos力場，用kollman-all-atom電荷計(jì)算出HSA三維結(jié)構(gòu)的勢能；再用Surflex程序來確定BPTA與HSA分子之間的相互作用模式[6]。

1.2.2熒光偏振度及同步熒光的測定實(shí)驗(yàn)選擇激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度均為5 nm,依據(jù)文獻(xiàn)方法[7]，以激發(fā)波長280 nm,發(fā)射波長348 nm測定熒光偏振;以230 nm為激發(fā)波長，290 nm為發(fā)射波長測定同步熒光(△λ=60 nm)。

1.2.3三維熒光光譜實(shí)驗(yàn)選擇擇激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，分別測定激發(fā)波長在230～325 nm范圍，發(fā)射波長在230～480 nm范圍的三維熒光光譜。

1.2.4紫外吸收光譜依次移取一定量的HSA和BPTA儲(chǔ)備液于10 mL比色管中，用pH=7.40的Tris-HCl 緩沖溶液定容，以試劑空白為參比,掃描HSA-BPTA體系在200～350 nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。

1.2.5鍵合參數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)的測定實(shí)驗(yàn)選擇激發(fā)/發(fā)射波長為280/348 nm，采用熒光滴定法,分別測定溫度299 K、309 K和319 K下BPTA-HSA體系的熒光強(qiáng)度,再依據(jù)相應(yīng)的公式[8]計(jì)算結(jié)合常數(shù)。

1.2.6位點(diǎn)標(biāo)記的競爭實(shí)驗(yàn)采用熒光滴定法，向BPTA-HSA體系分別加入一定量的Phenylbutazone (PB)、Flufenamic(FA)和Digitoxin(Dig)，分別作為位點(diǎn)Ⅰ、位點(diǎn)Ⅱ、位點(diǎn)Ⅲ的標(biāo)記藥物[9]。選擇激發(fā)/發(fā)射波長為280/348 nm，測定HSA-BPTA體系在溫度298 K的熒光強(qiáng)度。

1.2.7抗菌活性測定選取大腸桿菌、白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、四聯(lián)球菌、藤黃八疊球菌及白色念珠菌作為實(shí)驗(yàn)菌，以環(huán)丙沙星藥物做對照，用微量稀釋法進(jìn)行抗菌藥物的初步篩選[10]。

2 結(jié)果與討論

2.1 BPTA分子的優(yōu)化結(jié)構(gòu)及光學(xué)活性

圖2 BPTA的優(yōu)化結(jié)構(gòu)Fig.2 The optimized structure of BPTA

圖2為優(yōu)化的BPTA分子的三維結(jié)構(gòu),計(jì)算得到其最高占有軌道能量(HOMO)為-8.9604 eV，最低未占分子軌道能量(LUMO)為-4.1663 eV。

圖3為常溫下BPTA在甲醇中的熒光光譜，圖中曲線a為激發(fā)波長為296 nm時(shí)，BPTA的熒光發(fā)射光譜，顯示最大發(fā)射峰位置在366 nm處；而曲線b為發(fā)射波長為366 nm時(shí)，BPTA的激發(fā)光譜。表明濃度在10-3mol·L-1數(shù)量級(jí)條件下，BPTA有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，這是由于BPTA分子中存在部分的共軛π鍵結(jié)構(gòu)，也存在N的給電子取代基的原因[11]。

圖4為BPTA在Tris-HCl緩沖溶液中的紫外-可見光譜,呈現(xiàn)明顯的雙峰,其最大吸收波長位于206 nm,應(yīng)是苯環(huán)的E2特征吸收帶(204 nm)發(fā)生的紅移,一是溴原子作為助色團(tuán)的存在,二是溶劑效應(yīng),Tris-HCl緩沖液是水溶液體系。另在245 nm 處有一肩峰,推斷是BPTA分子中部分共軛骨架的π-π*躍遷導(dǎo)致的K吸收帶[12]。通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得BPTA在Tris-HCl緩沖液中的摩爾吸光系數(shù)ε為3.365×104L·mol-1·cm-1。

圖3 BPTA在甲醇中的熒光發(fā)射光譜及激發(fā)光譜Fig.3 Fluorescence spectra of BPTA in methanol a：emission spectra;b：excitation spectra.cBPTA=1.3×10-3 mol·L-1.

圖4 BPTA在Tris-HCl緩沖溶液中的紫外-可見光譜Fig.4 UV-Vis spectra of BPTA in Tris-HCl buffer a-i:cBPTA:3.33,6.67,10,13.33,16.67,20,23.33,26.67,30 (×10-6 mol·L-1);T=298 K.

以上結(jié)果表明BPTA分子不僅有較大的空間位阻,也具有良好的光譜特征,可為今后研發(fā)BPTA作為新型藥物的設(shè)計(jì)及分析其含量提供科學(xué)合理的依據(jù)。

圖5 BPTA與HSA的模型對接圖(HSA的氨基酸殘基用飄帶狀表示，BPTA用棍狀表示)Fig.5 The binding mode between BPTA and HSA,only residues around 8 ? of BPTA is displayed The residues of HSA are represented using ribbon model and the BPTA structure is represented using ball and stick model.

2.2 BPTA與HSA作用的結(jié)合位點(diǎn)確定

圖5為BPTA鍵合HSA的分子模擬圖?？煽闯觯琀SA分子有合適的空間容納BPTA分子,而BPTA分子也可以鍵合在HSA分子的疏水腔內(nèi)，整個(gè)分子呈非平面結(jié)構(gòu)，且很靠近HSA分子的苯丙氨酸(Phe)134和酪氨酸(Tyr)160，這不僅是BPTA與HSA的鍵合存在疏水作用的一個(gè)有力證據(jù)，也表明BPTA能猝滅HSA的內(nèi)源熒光，與后面的有關(guān)熒光光譜法的測定結(jié)果一致。另外，還顯示出BPTA與HSA氨基酸殘基的精氨酸(Arg)117位(距離:2.029 ? 和2.509 ?)及(Arg)186(距離:2.271 ?) 位可形成三個(gè)氫鍵,這就使得體系的親水性降低,疏水性增大。這些結(jié)果均說明BPTA鍵合HSA的反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的，作用力的模式主要是疏水作用，兼有氫鍵作用。

為確定BPTA與HSA作用的結(jié)合位點(diǎn)，選擇對HSA具有特異結(jié)合性的三種競爭試劑Phenylbutazone (PB)、Flufenamic(FA)和Digitoxin(Dig)分別作為空間區(qū)域位點(diǎn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 的標(biāo)記藥物[13]。結(jié)果表明,與不加競爭試劑時(shí)的結(jié)合常數(shù)K值和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n值相比,均發(fā)生較大程度的變化。其中加入FA標(biāo)記藥物時(shí)，K值和n值的變化最明顯，說明BPTA與HSA的結(jié)合在位點(diǎn)Ⅱ,但結(jié)合位點(diǎn)數(shù)卻很小,進(jìn)一步說明FA是HSA高選擇性的位點(diǎn)Ⅱ標(biāo)記物，隨FA的加入,與BPTA競爭位點(diǎn)Ⅱ,使得BPTA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)減少。

2.3 BPTA與HSA作用的光譜表征

通過改變BPTA的濃度測定HSA的熒光偏振值。結(jié)果顯示，在不同溫度(309 K與319 K)下,隨BPTA濃度的增大(0～40.00×10-6mol·L-1)，熒光偏振值的變化不明顯，且數(shù)值都較小(均小于0.05)。說明溫度對熒光偏振值的影響不大；較小的偏振值暗示BPTA與HSA結(jié)合得松，結(jié)合后的大分子弛豫時(shí)間短，使HSA在從螺旋到無規(guī)卷曲伸展變化時(shí)，由于撓性增大，故熒光偏振就小[14]。

在蛋白質(zhì)分子中,同步熒光(△λ=60 nm)呈現(xiàn)的是Trp殘基的光譜特征[13]。圖6為BPTA-HSA體系的同步熒光光譜圖?？梢钥闯觯築PTA的存在猝滅了HSA的Trp殘基熒光,熒光強(qiáng)度從115降至90左右,其最大熒光發(fā)射峰位置基本未變,說明BPTA對HSA微環(huán)境有一定影響。

蛋白質(zhì)的約210 nm處的峰是肽鍵的強(qiáng)吸收峰，其最大吸收峰反映其α-螺旋結(jié)構(gòu)的信息[15]。圖7為HSA、BPTA及BPTA-HSA體系的紫外光譜圖?？煽闯鯤SA最大吸收波長位于206 nm左右,隨BPTA濃度的增加,HSA-BPTA體系的吸收強(qiáng)度相應(yīng)增加,雖最大吸收波長的位置未發(fā)生變化,但峰形與BPTA的吸收峰形有明顯差異(圖4)。以上結(jié)果說明:BPTA確實(shí)與HSA發(fā)生了相互作用,使得HSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生一定變化。

圖6 BPTA-HSA體系的同步熒光光譜圖(△λ=60 nm)Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of BPTA-HSA system(△λ=60 nm) a:cHSA=3.0×10-6 mol·L-1;b-g:cBPTA:6.67,13.33，20.00，26.67，33.33，40.00(×10-6 mol·L-1).

圖7 BPTA-HSA體系的紫外(UV)光譜圖Fig.7 UV spectra of BPTA-HSA systems cHSA=2.0×10-6 mol·L-1;a-f:cBPTA:0,2.67,5.33,8.00,10.67,13.33(×10-6 mol·L-1);T=298 K.

圖8為HSA-BPTA體系的三維熒光光譜?？煽闯?，兩種熒光光譜圖的峰形均呈現(xiàn)規(guī)則形狀；隨BPTA濃度的加大，BPTA猝滅了HSA的內(nèi)源色氨酸殘基的熒光,且最大發(fā)射波長從350 nm紅移至360 nm。一是由于BPTA的分子結(jié)構(gòu)中存在的三氮唑環(huán)上的N原子為給電子基團(tuán)，導(dǎo)致熒光光譜產(chǎn)生位移，及吸收光強(qiáng)度的增大(圖7)；二是加入BPTA后，使得HSA的微環(huán)境極性增大，從而形成規(guī)則的發(fā)射光譜[8]。以上均說明BPTA的存在對HSA的色氨酸殘基所處的微環(huán)境引起的差異,也表明了HSA分子中構(gòu)象的變化。

圖8 (A) HSA的三維(3D)熒光光譜圖(cHSA=3.0×10-6mol·L-1);(B) BPTA-HSA體系的三維(3D)熒光光譜圖(cBPTA=4.0×10-5mol·L-1) Fig.8 (A) The 3D fluorescence spectra of HSA(cHSA=3.0×10-6mol·L-1);(B) The 3D fluorescence spectra of BPTA-HSA system(cBPTA=4.0×10-5 mol·L-1)

2.4 BPTA對HSA作用的熒光猝滅機(jī)理

在模擬生理?xiàng)l件(pH=7.40 的Tris-HCl緩沖液)下，選取三個(gè)不同溫度(299 K、309 K及319 K)進(jìn)行熒光滴定的測定，獲得Stern-Volmer圖(略)及KSV值(表1)，猝滅曲線的斜率即猝滅常數(shù)KSV值均為103數(shù)量級(jí)，猝滅速率常數(shù)均大于2.0×1010L·mol-1·s-1，且隨溫度的增大而減小，再結(jié)合吸收光譜(圖7)，表明BPTA對HSA的熒光猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅[13]。

表1 不同溫度下BPTA-HSA的鍵和常數(shù)及熱力學(xué)常數(shù)

2.5 BPTA與HSA的鍵合參數(shù)及模式確定

圖9 BPTA-HSA體系的Stern-Volmer圖Fig.9 The Stern-Volmer plot for BPTA-HSA systems cHSA=3.0×10-6 mol·L-1.pH=7.40;λex=280 nm,λem=348 nm.

在不同溫度下進(jìn)行熒光滴定實(shí)驗(yàn)，依據(jù)修飾的Stern-Volmer公式求得鍵合常數(shù)及鍵合位點(diǎn)數(shù)[13,16]，見表1及圖9，可看出BPTA與HSA的鍵合常數(shù)K值(104數(shù)量級(jí))都較大，且隨溫度的增大，K值呈增大趨勢，而鍵合位點(diǎn)數(shù)n呈減小趨勢。說明BPTA對HSA的鍵合作用較強(qiáng)，且溫度的變化會(huì)影響鍵合常數(shù)的大小。

利用Van’t Hoff方程，根據(jù)不同溫度下KSV的值可求得BPTA與HSA作用的熱力學(xué)常數(shù)(表1)，△G值表明BPTA與HSA的鍵合過程是自發(fā)進(jìn)行的;△H值及△S值表明氫鍵和范德華力為主要的鍵合模式。綜合分子模擬與熱力學(xué)計(jì)算的結(jié)果，得出：BPTA主要以疏水作用、氫鍵及范德華力鍵合HSA。

根據(jù)F?rster 非輻射能量轉(zhuǎn)移理論[13],將HSA看做能量轉(zhuǎn)移給體，BPTA為能量轉(zhuǎn)移受體，測定HSA的熒光光譜與BPTA的吸收光譜重疊圖(圖略)，求得光譜重疊部分的積分值為2.424×10-14cm3·L·mol-1，臨界距離R0為4.02 nm，r值為6.42 nm。結(jié)果表明：在BPTA與HSA之間確實(shí)發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移；同時(shí)BPTA在HSA的結(jié)合位置與Trp殘基之間的距離r值小于7 nm，這也與前面的分子模擬結(jié)果相一致。

2.6 BPTA的抗菌活性

據(jù)報(bào)道，在臨床上引起系統(tǒng)性真菌感染的菌株主要是念珠菌屬;致病性大腸桿菌是醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)臨床感染中最常見的病原菌之一;葡萄球菌是最常見的化膿性球菌，是醫(yī)院交叉感染的重要來源;枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽性細(xì)菌,是一些重要工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌;蠟狀芽孢桿菌是常見的食品污染菌;四聯(lián)球菌是重要的食品腐敗性細(xì)菌；藤黃八疊球菌屬革蘭氏陽性細(xì)菌，是一種常用的抗生素測試菌。本文用微量稀釋法測定BPTA對以上8種病原菌的抑制活性。實(shí)驗(yàn)表明,BPTA對藤黃八疊球菌，大腸桿菌沒有表現(xiàn)出抑制活性(呈陰性結(jié)果)，但是對其他6種菌類均存在明顯的抑制活性(呈陽性結(jié)果)。這些結(jié)果表明BPTA 可作為一種潛在的新型抗菌藥物,有待進(jìn)行更深入地研究及開發(fā)應(yīng)用。

3 結(jié)論

研究了新合成的三氮唑化合物BPTA的抗菌活性及其與HSA的相互作用。幾種熒光光譜法測定的結(jié)果表明BPTA的存在影響了HSA的微環(huán)境及二級(jí)結(jié)構(gòu);分子模擬確定了BPTA在HSA 上的鍵合區(qū)域及模式，位點(diǎn)競爭實(shí)驗(yàn)確定了BPTA 在 HSA 上的位點(diǎn)Ⅱ鍵合。熱力學(xué)參數(shù)表明BPTA鍵合HSA的模式主要為氫鍵和范德華作用,與分子模擬的結(jié)果部分一致。獲得不同溫度下的鍵合常數(shù)說明BPTA與HSA有較強(qiáng)的鍵合作用。從分子水平上了解了BPTA與模型蛋白的鍵合反應(yīng)及作用機(jī)制。以上的結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)利用BPTA提供了一定的理論指導(dǎo)。