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        超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人血漿中氯苯那敏

        2015-10-17 03:32:18陳振玲
        分析科學(xué)學(xué)報(bào) 2015年6期
        關(guān)鍵詞:那敏氯苯工作液

        粟 燕, 陳振玲

        (1.凱里學(xué)院,貴州凱里 556011;2.中國(guó)民用航空局民用航空醫(yī)學(xué)中心,北京 100123;3.民航總醫(yī)院,北京 100123)

        氯苯那敏是第一代抗組胺藥物,它可以通過(guò)人體血腦屏障進(jìn)入大腦,與腦部組織胺H1受體結(jié)合,產(chǎn)生鎮(zhèn)靜作用,具體表現(xiàn)為嗜睡、困倦、反應(yīng)遲鈍等[1 - 3]。其說(shuō)明書(shū)中明確規(guī)定駕駛?cè)藛T工作期間禁用。國(guó)際民用航空公約附件13《航空器事故和事故征候調(diào)查》和《航空器事故和事故征候調(diào)查手冊(cè)》航空醫(yī)學(xué)調(diào)查規(guī)定,對(duì)飛行機(jī)組人員的藥物使用情況進(jìn)行調(diào)查,其中包括神經(jīng)類(lèi)藥物進(jìn)行檢查。目前我國(guó)保健品存在非法添加西藥的情況,存在飛行人員誤服等可能性。因此,有必要建立靈敏、準(zhǔn)確測(cè)定人血漿中氯苯那敏的檢測(cè)方法,以配合事故和事故征候的調(diào)查?,F(xiàn)已建立的血漿中氯苯那敏檢測(cè)分析方法有高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。但上述方法檢出限較高、前處理步驟較為繁瑣,無(wú)法滿(mǎn)足事故或事故征候調(diào)查的需要[4 - 6]。

        本研究建立了快速測(cè)定人體血漿中氯苯那敏的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測(cè)方法。該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、重復(fù)性好,不僅可以滿(mǎn)足民航事故或事故征候調(diào)查需要,還可以應(yīng)用于路面駕駛事故調(diào)查以及添加少量氯苯那敏復(fù)方制劑藥代動(dòng)力學(xué)研究。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 儀器、試劑與材料

        Waters XEVO TQ UPLC-MS/MS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó),沃特斯公司):BT25S百萬(wàn)分之一天平(德國(guó),Sartorius公司);Milli-Q超純水機(jī)(德國(guó),Millipore公司);SIGMA 3-18K型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó),Sigma公司)。

        氯苯那敏對(duì)照品溶液:精密稱(chēng)取1.00 mg氯苯那敏對(duì)照品(迪馬公司,批號(hào)1.4)于10 mL容量瓶中,加入甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。標(biāo)準(zhǔn)工作液由甲醇稀釋而成。內(nèi)標(biāo)阿托伐他汀對(duì)照品溶液:精密稱(chēng)取0.99 mg阿托伐他汀對(duì)照品(純度95.5%,中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)100590-200802)于10 mL容量瓶中,加入甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得質(zhì)量濃度為945 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。內(nèi)標(biāo)工作液由甲醇稀釋而成。甲醇(色譜純,F(xiàn)isher公司),乙酸銨(色譜純,Sigma公司),甲酸(優(yōu)級(jí)純,Sigma公司)。

        人體血漿由健康自愿者提供。

        1.2 樣品處理

        精密移取200 μL人體血漿于1.5 mL離心管中,加入10 μL氯苯那敏標(biāo)準(zhǔn)工作液,加入內(nèi)標(biāo)阿托伐他汀工作液2.0 μL,渦旋混勻60 s。加入甲醇500 μL,渦旋混勻60 s,4 ℃條件下,12 000 r/min離心10 min,取上清液測(cè)定。

        1.3 超高效液相色譜及質(zhì)譜條件

        色譜條件:Waters ACQUITY UPLC HSS C18色譜柱(150×2.1 mm,1.8 μm);流動(dòng)相:(A)5 mmol/L乙酸銨水溶液(0.1%甲酸),(B)甲醇,梯度洗脫條件為:0~3 min,35%~20%A;3~5 min,20%~10%A;流速為0.2 mL/min;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:5 μL。

        質(zhì)譜條件:離子源:電噴霧正離子源(ESI+),離子源溫度120 ℃;脫溶劑氣溫度350 ℃;脫溶劑氣流速650 L/h,毛細(xì)管電壓3.0 kV;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)檢測(cè)。

        表1 氯苯那敏和阿托伐他汀的質(zhì)譜分析參數(shù)

        *Quantitative ion.

        2 結(jié)果與討論

        2.1 樣品前處理方法的選擇

        實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇和乙腈兩種沉淀劑。結(jié)果表明,采用乙腈沉淀蛋白提取時(shí),血漿樣品成團(tuán)狀沉淀,造成氯苯那敏和阿托伐他汀提取不完全,重復(fù)性較差;采用甲醇沉淀蛋白提取時(shí),血漿沉淀呈均勻絮狀,重復(fù)性較好。分別考察了2、2.5、3、4倍的甲醇沉淀劑用量對(duì)氯苯那敏和阿托伐他汀響應(yīng)值的影響,結(jié)果表明隨著沉淀劑用量的增加,氯苯那敏信號(hào)峰逐漸變小。綜合考慮峰信號(hào)響應(yīng)值、方法的檢出限以及沉淀是否完全,選用2.5倍體積甲醇作為最佳沉淀劑用量。

        2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

        根據(jù)氯苯那敏和阿托伐他汀在電噴霧電離條件下的電離性質(zhì),選擇在ESI+離子化模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析,得到兩種化合物的準(zhǔn)分子離子[M+1]分別為m/z275.3、559.3。利用儀器自動(dòng)優(yōu)化功能進(jìn)一步對(duì)兩種化合物的準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析即子離子掃描,分別得到氯苯那敏和阿托伐他汀碎片離子信息,選擇合理丟失并且豐度較大的兩個(gè)碎片離子作為輔助定性離子,并以其中豐度最大的碎片離子作為定量離子,優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

        2.3 色譜條件優(yōu)化

        參考文獻(xiàn)的色譜條件[4 - 6],分別以甲醇和乙腈為有機(jī)相,并且考慮到血漿樣品中含有大量有機(jī)化合物,基體復(fù)雜,采用梯度洗脫(有機(jī)相由65%上升到90%)程序,考察氯苯那敏和阿托伐他汀的出峰情況。結(jié)果表明,采用乙腈為有機(jī)相時(shí),嘗試了多種梯度程序,兩種化合物的峰形均較差且拖尾;采用甲醇為有機(jī)相時(shí),兩種化合物峰形獲得很大改善。對(duì)于乙腈和甲醇分別為有機(jī)相洗脫氯苯那敏和阿托伐他汀色譜峰出現(xiàn)的差別,推測(cè)兩種化合物在色譜柱洗脫過(guò)程中,它們與固定相、流動(dòng)相及樣本本身組分之間的復(fù)雜相互作用有關(guān),當(dāng)乙腈為有機(jī)相時(shí)洗脫過(guò)程中兩種化合物在血漿組分影響下與固定相結(jié)合比較復(fù)雜,隨乙腈梯度增大難以迅速脫離固定相,形成拖尾;當(dāng)甲醇為有機(jī)相時(shí)洗脫過(guò)程中兩種化合物在血漿組分影響下與固定相結(jié)合比較簡(jiǎn)單,隨甲醇梯度增加迅速脫離固定相隨流動(dòng)相進(jìn)入檢測(cè)器。當(dāng)水相采用0.1%甲酸水溶液時(shí),兩種化合物響應(yīng)值較低,并且重復(fù)性較差;水相加入乙酸銨時(shí),兩種化合物響應(yīng)值增加,并且重復(fù)性得以改善,說(shuō)明乙酸銨可以促進(jìn)兩種化合物的電離。選用乙酸銨濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mmol/L,優(yōu)化乙酸銨用量,結(jié)果表明隨著乙酸銨濃度增加兩種化合物響應(yīng)值逐漸增大,濃度達(dá)到5.0 mmol/L時(shí)響應(yīng)值不再增加,因此選擇乙酸銨用量5.0 mmol/L。在上述色譜質(zhì)譜條件下,血漿樣品色譜分離良好,內(nèi)源性物質(zhì)不干擾氯苯那敏和阿托伐他汀的測(cè)定,見(jiàn)圖1和圖2。

        圖1 氯苯那敏色譜圖(下圖:空白血漿;上圖:空白血漿+氯苯那敏)Fig.1 The chromatograms of Chlortrimeton (a) Blank plasma+Chlortrimeton;(b) Blank plasma.

        圖2 內(nèi)標(biāo)阿托伐他汀色譜圖(下圖:空白色漿;上圖:空白色漿+阿托伐他汀)Fig.2 The chromatograms of Atorvastatin(ISTD) (a) Blank plasma+Atorvastatin;(b) Blank plasma.

        2.4 基質(zhì)效應(yīng)、檢出限、定量限及線(xiàn)性范圍

        首先考察基質(zhì)效應(yīng),取200 μL空白血漿,精密加入氯苯那敏系列對(duì)照品溶液10 μL和內(nèi)標(biāo)阿托伐他汀工作液2.0 μL,配制成氯苯那敏濃度為0.5、20.0、40.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品各5份,按照1.2節(jié)方法處理并進(jìn)行分析;同法分別用水代替血漿,按照上述方法處理。以每一種濃度的兩種不同處理方法分析得到的峰面積比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng),內(nèi)標(biāo)阿托伐他汀的基質(zhì)效應(yīng)值為102.1%±4.6%,表明阿托伐他汀無(wú)明顯的基質(zhì)效應(yīng)。表2數(shù)據(jù)表明,血漿對(duì)氯苯那敏基質(zhì)效應(yīng)不顯著。

        表2 血漿中氯苯那敏的基質(zhì)效應(yīng)考察

        以3倍信噪比(S/N)作為檢出限,以10倍S/N作為定量限,經(jīng)過(guò)不斷稀釋樣品并分析檢測(cè),血漿樣品中氯苯那敏的檢出限為0.05 μg/L,定量限為0.1 μg/L。

        取200 μL空白血漿,加入氯苯那敏對(duì)照品,配制0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入內(nèi)標(biāo)阿托伐他汀工作液后,按照1.2節(jié)方法沉淀提取,進(jìn)行色譜質(zhì)譜分析,記錄氯苯那敏和阿托伐他汀峰面積,以氯苯那敏和阿托伐他汀峰面積比值(Y)對(duì)氯苯那敏質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線(xiàn)性回歸,血漿樣品中氯苯那敏標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為:Y=0.0772X-0.0023(r=0.9995),線(xiàn)性范圍為0.1~50.0 μg/L。

        2.5 回收率、精密度及穩(wěn)定性

        分別取含有氯苯那敏0.5、20.0和40.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品,加入內(nèi)標(biāo)阿托伐他汀工作液2.0 μL,按照1.2節(jié)方法沉淀提取,測(cè)得氯苯那敏和阿托伐他汀的峰面積比,計(jì)算血漿中氯苯那敏的加入回收率,結(jié)果如表3所示。分別取含有氯苯那敏的低、中、高三種不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品,加入阿托伐他汀內(nèi)標(biāo)工作液,分別測(cè)定5次,計(jì)算精密度(RSD)。表3結(jié)果表明,血漿測(cè)定的日內(nèi)及日間RSD小于10%(n=5),滿(mǎn)足藥物動(dòng)力學(xué)研究要求。

        表3 血漿中氯苯那敏的添加回收率及日內(nèi)、日間精密度(n=5)

        考察了氯苯那敏在不同儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性。配制含有氯苯那敏的低、中、高三種不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品,分別于室溫24 ℃放置8 h,于-20 ℃冰箱放置30 d,于-20 ℃冰箱凍存并反復(fù)凍融3次后處理樣品并進(jìn)行檢測(cè),考察其室溫穩(wěn)定性、凍存穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性(n=5);另考察經(jīng)過(guò)處理的質(zhì)控樣品放在儀器自動(dòng)進(jìn)樣室10 ℃、12 h后的穩(wěn)定性(n=5)。結(jié)果表明測(cè)定值的變異系數(shù)均小于15%,表明氯苯那敏的血漿樣品在室溫24 ℃放置8 h、-20 ℃冰箱放置30 d、反復(fù)凍融3次情況下,仍保持穩(wěn)定;處理后待檢的樣品在儀器自動(dòng)進(jìn)樣室10 ℃、12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

        3 結(jié)論

        建立了人血漿中氯苯那敏的UPLC-MS/MS測(cè)定方法。該方法快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、選擇性好、靈敏度高,可為可疑氯苯那敏藥物相關(guān)的民用航空器事故或事故征候調(diào)查提供靈敏可靠的檢測(cè)方法,并且可以用于路面駕駛事故調(diào)查及添加少量氯苯那敏復(fù)方制劑中氯苯那敏藥代動(dòng)力學(xué)研究。

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