夏碧琪， 陳祥準(zhǔn)， 程 潔， 沈祥茹， 沈 燕， 韓 超*

(1.溫州出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江溫州 325027；2.溫州大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，浙江溫州 325035)

PPCPs(Pharmaceuticals and Personal Care Products，PPCPs)是近年來備受關(guān)注的一類環(huán)境新型污染物，包括抗生素、止痛劑、鎮(zhèn)定劑等藥物，以及芳香劑、紫外吸收劑、防腐劑等個(gè)人護(hù)理用品[1 - 3]。PPCPs具有生物累積性等特點(diǎn)，對(duì)人類健康具有潛在的危險(xiǎn)[4]。二苯甲酮類物質(zhì)是紫外吸收劑和引發(fā)劑，也是有機(jī)顏料、醫(yī)藥、香料、殺蟲劑的中間體[6]。然而，Rhodes等完成的毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，二苯甲酮類物質(zhì)對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物不僅具有致癌作用，而且還有皮膚接觸毒性和生殖毒性，從而對(duì)人類健康造成嚴(yán)重影響[6]。

目前，二苯甲酮類物質(zhì)的檢測(cè)方法有分光光度法[7]、高效液相色譜法[8]、氣相色譜-質(zhì)譜法[9]、液相色譜-質(zhì)譜法[10,11]等。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法具有較高的選擇性和靈敏度[12，13]，本研究采用甲醇超聲提取樣品，固相萃取柱凈化及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，建立了同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中羊棲菜、紫菜、帶魚和黃魚中2，4-二羥二苯甲酮、2，2′，4，4′-四羥基二苯甲酮、乙-羥基-4-甲氧基二苯甲酮3種二苯甲酮類物質(zhì)的分析方法，采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，方法靈敏度高，定性定量準(zhǔn)確。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

Agilent1200高效液相色譜儀(美國(guó)，Agilent公司)；API 4000三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)，AB應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；MCX固相萃取柱(60 mg/3mL，使用前以5.0 mL甲醇和 1%乙酸水溶液活化)。

2，4-二羥二苯甲酮、2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮均購自Accustandard公司(純度≥99.0%)，2,2′,4,4′-四羥基二苯甲酮購自Chemservice公司(純度≥98.5%)。內(nèi)標(biāo)2，4-二羥二苯甲酮-D5、2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮-D5均購自C/D/N Isotopes Inc公司(純度≥97.5%)。3種二苯甲酮類化合物用甲醇配制成200 μg·mL-1的儲(chǔ)備液，使用時(shí)用甲醇稀釋，配制成5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中內(nèi)標(biāo)濃度均為20.0 ng·mL-1。甲醇、乙腈均為色譜純(德國(guó)MERCK公司)；甲酸、乙酸、甲酸銨、乙酸銨(美國(guó)Alfa Aesar公司)；其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

水產(chǎn)品樣品購自當(dāng)?shù)夭藞?chǎng)。

1.2 樣品處理與凈化

1.2.1提取稱取樣品約2 g(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管中，加入0.1 mL同位素內(nèi)標(biāo)溶液(1 000 ng·mL-1) 和20 mL甲醇，混勻后，超聲提取30 min，提取溫度為30 ℃，于4 000 r·min-1離心5 min，過濾并用甲醇定容到25 mL 容量瓶中，待凈化。

1.2.2凈化取上述待凈化溶液10 mL，溫度40 ℃氮?dú)獯抵两?，先? mL甲醇-1%乙酸水溶液溶解殘?jiān)?，再加? mL水，混勻后使該樣液以小于1 mL·min-1的流速通過MCX固相萃取柱。樣液全部流出后，先用6 mL 1%乙酸水溶液和6 mL 20%甲醇水溶液淋洗，負(fù)壓抽干，再用4 mL甲醇和2 mL 2%氨水甲醇溶液依次洗脫，洗脫液在40 ℃用氮?dú)獯抵两?，? mL甲醇溶解殘?jiān)?，過0.22 μm微孔濾膜后，供LC-MS/MS測(cè)定。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1液相色譜條件Agilent ZOBRAX C18色譜柱(150×2.1 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%乙酸水溶液。梯度洗脫程序：0～2 min，30%～80%A；2～10 min，80%～80%A；流速：300 μL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件電噴霧離子(ESI)源：正、負(fù)離子掃描；離子源溫度500 ℃；電噴霧電壓5 000 V；霧化氣(GS1) 壓力344.5 kPa；輔助氣流速(GS2) 275.6 kPa；氣簾氣壓力68.9 kPa；碰撞氣壓力137.8 kPa。監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 化合物多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Optimised MRM parameters for the determination of compounds

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將標(biāo)準(zhǔn)品配制成200 ng·mL-1溶液，通過流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣，調(diào)諧質(zhì)譜參數(shù)。使用ESI源在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描以選擇適當(dāng)?shù)亩ㄐ?、定量離子和電離方式。結(jié)果表明：在ESI源的負(fù)離子模式下，2，4-二羥二苯甲酮、2,2′,4,4′-四羥基二苯甲酮呈現(xiàn)出最佳響應(yīng)，準(zhǔn)分子離子[M-H]-是響應(yīng)強(qiáng)度最高的離子。在ESI源的正離子模式下，2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮呈現(xiàn)出最佳響應(yīng)，準(zhǔn)分子離子[M+H]+是響應(yīng)強(qiáng)度最高的離子。在確定母離子后，采用子離子掃描方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。分別選取豐度較強(qiáng)的主要碎片離子作為定量離子和輔助定性離子。進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量、透鏡電壓等質(zhì)譜參數(shù)，使各分析化合物的響應(yīng)最大化。質(zhì)譜參數(shù)及母離子和子離子詳見表1。

2.2 流動(dòng)相的選擇

分別考察了以甲醇-水和乙腈-水混合體系為流動(dòng)相，以及在流動(dòng)相中分別添加甲酸、乙酸、甲酸銨和乙酸銨等溶液對(duì)目標(biāo)物色譜行為和離子化程度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中添加乙酸可顯著改善3種待測(cè)物的靈敏度，故最終以乙腈-0.1%乙酸水溶液為流動(dòng)相，在梯度洗脫條件下進(jìn)行分析，MRM色譜圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of standards a.2,4-dihydroxybenzophenone；b.2,2′,4,4′-tetrahydroxybenzophenone；c.2,4-dihydroxybenzophenone-D5；d.2-hydroxy-4-methoxybenzophenone；e.2-hydroxy-4-methoxybenzophenone-D5.

2.3 固相萃取柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)分別考察了3個(gè)不同品牌的固相萃取柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCX固相萃取柱的凈化效果較好，對(duì)3種待測(cè)物的回收率均可達(dá)到82%以上。因此，本實(shí)驗(yàn)采用MCX柱進(jìn)行凈化處理。MCX固相萃取柱用5.0 mL甲醇和1%乙酸水溶液活化。

2.4 方法的線性范圍與相關(guān)系數(shù)

實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量消除基質(zhì)效應(yīng)，空白樣品按照1.2節(jié)前處理，配制一系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在選定的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以分析物與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比(y)為縱坐標(biāo)，以分析物與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度之比(x)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析(2，4-二羥二苯甲酮、2,2′,4,4′-四羥基二苯甲酮為定量分析時(shí)選擇2,4-二羥二苯甲酮-D5為內(nèi)標(biāo)物；2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮選擇2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮-D5為內(nèi)標(biāo)物)。結(jié)果表明，2，4-二羥二苯甲酮、2,2′,4,4′-四羥基二苯甲酮和2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮在5.0～100.0 ng·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性，其線性方程分別為：y=0.0247x+0.0158(r2=0.9993)；y=0.0331x+0.0724(r2=0.9995)；y=0.0576x+0.0937(r2=0.9996)。

2.5 方法的回收率與定量限

以10倍信噪比(S/N)為方法定量限(LOQ)，確定2，4-二羥二苯甲酮、2,2′,4,4′-四羥基二苯甲酮、2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮的定量限為10.0 μg·kg-1。選擇 3 個(gè)添加水平，平行測(cè)定6 次，回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)列于表2。由表2可知，方法顯示了較好的回收率與精密度。

表2 4種水產(chǎn)品的定量限、加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 LOQ,recoveries and RSDs of three benzophenone in aquatic samples(n=6)

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)市場(chǎng)上售賣的12種水產(chǎn)品樣品進(jìn)行了分析測(cè)定，未檢出該3種二苯甲酮類化合物。

3 結(jié)論

本文建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品羊棲菜,紫菜,帶魚,黃魚中3種二苯甲酮類化合物的分析方法。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏，滿足水產(chǎn)品中上述3種二苯甲酮類化合物同時(shí)定性定量分析的要求。