肖永華*， 梁高道， 革麗亞， 黃常剛， 王 勝， 麥 琦

(武漢市疾病預防控制中心，湖北武漢 430022)

全氟化合物(Perfluorinated Compound，PFCs)是一類氟化有機物，它具有疏水、疏油、熱穩(wěn)定性及化學穩(wěn)定性好、表面活性高，已廣泛應用于工業(yè)生產與消費領域。有報道稱含氟聚合物生產廠以及污水處理廠是全氟化合物的主要污染源[1]。研究表明，PFCs在魚肉、蝦、豬肉、雞蛋以及飲用水中均有檢出，同時PFCs具有很高的穩(wěn)定性，在環(huán)境中不易被降解，進入生物體后會隨著食物鏈不斷累積，而人類處于食物鏈的最末端，所攝入的PFCs要遠遠高于其他生物體。毒理學研究表明，PFCs在一定劑量下具有肝毒性、免疫毒性、神經(jīng)毒性、內分泌干擾效應及潛在致癌性等多種毒性效應[2]。隨著PFCs的污染越來越受到重視，因此通過檢測人體血清中PFCs的含量來評價人群PFCs的暴露具有重要的意義。

目前檢測PFCs大多采用液相色譜-串聯(lián)質譜法[3 - 18]，其優(yōu)點是抗干擾能力強、選擇性好、靈敏度高，在檢測痕量PFCs時具有顯著的優(yōu)勢。在樣品處理時采用較多的有石墨化炭黑分散萃取[2]、酸水解[3]、堿水解[4]、離子對試劑提取[5]以及聚酰胺粉提取[6]等。在上述研究的基礎上，本實驗采用酶解法來提取血清中PFCs，提取液經(jīng)沉淀蛋白以及WAX固相萃取小柱凈化后，采用超高效液相色譜/串聯(lián)質譜法測定。該方法能有效地去除基質干擾，穩(wěn)定性好，準確度高，可作為評價人群PFCs暴露的重要技術支撐。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

UPLC-TQD超高效液相色譜/串聯(lián)質譜儀(美國，Waters公司)，配備電噴霧離子源(ESI)及Masslynx4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；AL204電子天平(瑞士，Mettler Toledo公司)；固相萃取裝置(美國,Agilent公司)；氮氣吹干儀(美國,Organomation Associates公司)；渦旋儀(德國,IKA公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)；低速臺式離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。

標準品：全氟己烷磺酸(PFHxS)、全氟庚酸(PFHpA)、全氟辛酸(PFOA)、全氟辛烷磺酸(PFOS)、全氟壬酸(PFNA)、全氟癸酸(PFDA)、全氟十一酸(PFUnDA)，均購自Sigma-Aldrich公司；內標：13C4全氟辛酸(MPFOA)、13C4全氟辛烷磺酸(MPFOS)，均購自美國Sigma公司。β-葡萄糖醛苷酶(美國Sigma公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國天地公司)；NaAc、NaOH、NH4Ac(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；HClO4(優(yōu)級純，天津市東方化工廠)；氨水(分析純，開封東大化工有限公司試劑廠)；WAX固相萃取小柱(60 mg，3 mL，美國Waters公司)。實驗用水為超純水。

1.2 標準溶液配制

標準、內標儲備液(100 mg/L)：分別準確稱取0.0100 g全氟化合物標準品于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度；內標用甲醇溶解，轉移至100 mL棕色容量瓶中，-18 ℃冷凍保存。標準、內標中間液(1 mg/L)：分別準確吸取1.00 mL儲備溶液于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，4 ℃保存。內標工作液(50 μg/L)：準確吸取5.00 mL內標工作液于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，4 ℃保存。標準工作液：臨用時將標準中間液稀釋至合適濃度標準系列，標準系列中內標濃度均為5 μg/L。

1.3 樣品處理

稱取1.00 g血清樣品于15 mL離心管中，加入5.0 mL 0.2 mol/L的NaAc緩沖溶液以及100 μL內標工作液，充分混勻，再加入50 μLβ-葡萄糖醛苷酶，混勻后，于溫度37 ℃酶解提取12 h。在提取液中加入200 μL HClO4，充分渦旋后離心10 min，將上清液轉移至另一15 mL離心管中，用NaOH溶液調節(jié)溶液pH值至中性。

將WAX固相萃取小柱分別用3 mL甲醇和3 mL水活化后，取提取液過柱，用5 mL 50%甲醇水溶液淋洗，最后用5%氨水甲醇溶液洗脫，洗脫液經(jīng)氮氣吹干后用1.0 mL甲醇溶解，以0.22 μm濾膜過濾后，用超高效液相色譜/串聯(lián)質譜儀進行分析。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC?HSS C18柱(100×2.1 mm,1.8 μm)；流動相：A：乙腈，B：5 mmol/L NH4Ac緩沖溶液。梯度洗脫程序：0～3.0 min,30%～70%A;3.0～6.0 min,70%A;6.0～6.1 min，70%～30%A;流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

1.4.2質譜條件離子源：電噴霧(ESI)，負離子模式；毛細管電壓：-2.3 kV；脫溶劑氣溫度：350 ℃；離子源溫度：120 ℃；掃描模式：多反應監(jiān)測(MRM)。采用質譜直接進樣的方式優(yōu)化各全氟化合物的采集參數(shù)，7種全氟化合物及2種內標的MRM參數(shù)見表1。

表1 7種全氟化合物及2種內標的MRM參數(shù)Table 1 The MRM parameters of 7 PFCs and 2 internal standards

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

圖1 7種全氟化合物及2種內標的總離子流色譜圖(TIC)Fig.1 TIC of 7 PFCs and 2 internal standards 1,2：PFHxS，PFHpA；3,4：MPFOA，PFOA；5,6,7.PFOS，MPFOS，PFNA；8：PFDA；9：PFUnDA.

實驗比較了甲醇-NH4Ac緩沖溶液和乙腈-NH4Ac緩沖溶液兩種體系的分離效果、靈敏度以及背景干擾。結果表明，在這兩種體系中，PFCs各組分峰形良好，靈敏度沒有明顯差異。但在甲醇-NH4Ac緩沖體系中，PFNA、PFOA以及PFHxS存在背景干擾現(xiàn)象，而乙腈-NH4Ac緩沖體系中沒有明顯的背景干擾，因而本實驗選擇乙腈-NH4Ac緩沖溶液體系作為流動相。PFCs各組分的總離子流色譜圖見圖1。

2.2 樣品前處理的優(yōu)化

文獻報道樣品處理時采用較多的有酸水解、堿水解、離子對試劑提取以及石墨化炭黑分散萃取等。由于PFCs與蛋白結合在一起，常規(guī)的乙腈沉淀蛋白不能有效地提取血清中的PFCs，在回收率實驗中，血清樣品加入7種全氟化合物及2種內標后，通過乙腈沉淀蛋白，離心后取上清液直接測定時7種全氟化合物及2種內標的響應值均明顯降低，回收率均小于50%。因而本實驗首先利用酶解的方法使與蛋白相結合的PFCs 釋放出來，再加入HClO4沉淀蛋白質，離心后上清液用NaOH溶液調節(jié)至中性，將溶液過WAX固相萃取小柱，用3.0 mL 50%甲醇水溶液淋洗小柱，最后用3.0 mL 5%氨水甲醇溶液作為洗脫液洗脫小柱所吸附的PFCs(本實驗曾分別用3.0 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫兩次，結果發(fā)現(xiàn)所有PFCs組分均在第一次被完全洗脫下來)，洗脫液經(jīng)氮氣吹干后用1.0 mL甲醇復溶。

2.3 線性范圍、回收率、精密度及檢出限

全氟羧酸類化合物PFHpA、PFOA、PFNA、PFDA、PFUnDA以MPFOA為內標，全氟磺酸類化合物PFHxS、PFOS以MPFOS為內標，7種全氟化合物在1.0～50.0 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數(shù)均在0.995以上；在血清樣品中添加濃度為25 μg/kg的7種全氟化合物標準，內標MPFOS和MPFOA的添加濃度均為5 μg/kg，分別做6個加標平行樣和2個血清本底，7種全氟化合物的平均回收率為74.0%～105.6%，結果見表2。通過逐級稀釋法來確立本方法的檢出限，當7種PFCs進樣濃度為0.05 μg/L時，7種PFCs的信噪比均大于3，經(jīng)回收率校正后，選擇0.1 μg/kg作為本方法7種PFCs的檢出限。

表2 7種PFCs的回歸方程、線性范圍、相關系數(shù)及回收率(n=6)Table 2 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients and recoveries of 7 PFCs(n=6)

2.4 實際樣品的測定

隨機選擇24位本單位健康體檢人群的血清樣品測定PFCs，結果表明：PFHxS、PFOA、PFNA、PFOS、PFDA、PFUnDA均有檢出。PFOA、PFNA、PFOS、PFDA、PFUnDA檢出率均為100%，其中PFOA和PFOS的含量要遠高于其他4種PFCs。血清中PFHpA均未檢出，檢出情況詳見表3。血清樣品中PFOA和PFOS多反應監(jiān)測(MRM)色譜圖見圖2。

圖2 人體血清樣品中PFOA和PFOS多反應監(jiān)測(MRM)色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of PFOA and PFOS in human serum samples

表3 人體血清樣品中7種PFCs的測定結果Table 4 Determination results of 7 PFCs in human serum samples

3 結論

隨著食物鏈的富集，人體中的PFCs含量要遠高于環(huán)境以及食品中PFCs的含量，如何通過保護以及改善環(huán)境來控制和降低人群PFCs的攝入量，需要引起更多人的重視。本文通過對樣品前處理、色譜以及質譜條件的優(yōu)化，建立了固相萃取-超高效液相色譜/串聯(lián)質譜法測定人體血清中7種PFCs的分析方法。該方法靈敏度高，準確度好，可作為人群PFCs暴露監(jiān)測的技術支撐。