龔 強(qiáng)， 丁 利， 肖家勇， 姚碧容， 成 婧， 朱紹華， 付善良， 王利兵*

(1.湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，食品安全科學(xué)技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410004；2.湖南省婦幼保健院，湖南長(zhǎng)沙 410013)

當(dāng)今社會(huì)化學(xué)品的應(yīng)用非常廣泛，但其安全問(wèn)題也引起全球關(guān)注[1]。4,4′-二氨基-3,3′-二氯二苯甲烷(MOCA)是一種鹵化芳香胺化學(xué)品，可以用作澆注型橡膠聚氨酯的硫化劑、膠粘劑與聚氨酯涂料的交聯(lián)劑，也可用作環(huán)氧樹(shù)脂的固化劑。研究表明，MOCA具有嗅覺(jué)、行為及呼吸毒性，還有潛在的致癌作用，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)將它歸類為可能的致癌原(2A組)，歐盟REACH法規(guī)將其列為第6批高關(guān)注度化學(xué)品之一[2 - 5]。歐盟等國(guó)對(duì)相應(yīng)違法行為的處罰也越來(lái)越嚴(yán)厲[6]。

目前，已報(bào)道MOCA的檢測(cè)方法有液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法等，檢測(cè)對(duì)象主要是塑料、紡織品、食品接觸材料等[7 - 10]，但沒(méi)有生物樣品的檢測(cè)方法報(bào)道。因此，建立快速、有效地檢測(cè)方法，監(jiān)測(cè)高危人群體內(nèi)MOCA水平，用于評(píng)價(jià)健康和環(huán)境效應(yīng)意義重大。生物樣品如血液、尿液等的組成較為復(fù)雜，其中蛋白質(zhì)、內(nèi)源性物質(zhì)常高于待測(cè)成分?jǐn)?shù)倍乃至數(shù)千萬(wàn)倍，基質(zhì)干擾嚴(yán)重，影響方法的準(zhǔn)確度及靈敏度[11,12]。本文通過(guò)優(yōu)化樣品前處理方法、色譜及質(zhì)譜條件，建立了人體血液及尿液樣品中靈敏度高、重現(xiàn)性好的MOCA快速檢測(cè)方法，為高危人群的健康風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津20 A高效液相色譜儀(日本，島津公司)，帶自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱；API 4000質(zhì)譜檢測(cè)器(美國(guó)，AB公司)，含電噴霧(ESI)電離源和三重四級(jí)桿質(zhì)量分析器；SK-1快速混勻器(金壇市富華儀器有限公司)；BRANSON型超聲波清洗器(美國(guó)，必能信超聲有限公司)；電子分析天平(梅特勒-托利多(中國(guó))公司)。

4,4′-二氨基-3,3′-二氯二苯甲烷(MOCA)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer(純度>90.0%，德國(guó)Augsburg)。準(zhǔn)確稱取10 mg MOCA標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，配成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確移取儲(chǔ)備液100 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成10 μg/mL的中間標(biāo)準(zhǔn)工作液，于-4 ℃冷藏儲(chǔ)存。二氯甲烷、乙酸、甲酸為分析純(國(guó)藥集團(tuán))。乙腈、甲醇為色譜純(德國(guó)Merk公司)。實(shí)驗(yàn)用水由Millipore超純水儀制備。

1.2 樣品前處理

將新鮮離體血液37 ℃水浴30 min，3 000 r/min離心10 min，分離出血清。在血清和尿液樣品中加入質(zhì)量濃度為0.5%的檸檬酸，防止MOCA降解，4～5 d內(nèi)完成提取步驟或者置于-20 ℃長(zhǎng)期保存。

準(zhǔn)確吸取血清樣品0.5 mL、尿液樣品1.0 mL，加乙腈5.0 mL，振蕩混勻2 min，14 000/min離心10 min，上清液過(guò)活化的C18柱(C18柱依次用3.0 mL甲醇、3.0 mL水過(guò)柱活化)，流速<2.0 mL/min，提取液過(guò)柱后，分別用5 mL 5%甲醇水淋洗、5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，40 ℃氮?dú)獯抵两桑?.0 mL甲醇-水(1∶1，V/V)定容，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

1.3.1色譜條件色譜柱：Agilent Eclipse AAA柱(150×4.6 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為0.1% HAc溶液，80%A+20%B等度洗脫；流速：0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件離子源：電噴霧電離離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；霧化氣(Gas1)：60.00 psi；輔助氣(Gas2)：60.00 psi；離子噴霧電壓(IS)：5 kV；氣簾氣(CUR)：20.00 psi；離子化溫度(TEM)：450 ℃；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式(MRM)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

MOCA是芳香胺的一種，分子量小，極性較弱，參照文獻(xiàn)方法[4]對(duì)流動(dòng)相和色譜柱進(jìn)行條件優(yōu)化。分別采用乙腈、甲醇作為有機(jī)相，0.1%甲酸、0.1% HAc為水相，兩兩組合進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，乙腈-0.1% HAc溶液為流動(dòng)相時(shí)，保留時(shí)間、峰形、響應(yīng)3方面綜合比較最佳。另外，比較了C18柱、C8柱以及Agilent Eclipse AAA柱的分離效果，其中Agilent Eclipse AAA柱的分離峰形最好。因此選擇Agilent Eclipse AAA柱，采用乙腈-0.1% HAc溶液為流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離。

利用流動(dòng)注射直接進(jìn)樣，正離子模式掃描，優(yōu)化MOCA的質(zhì)譜條件。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 MRM檢測(cè)MOCA的部分質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Multiple reaction monitoring parameters of MOCA

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

圖1 不同提取方法結(jié)合不同凈化柱的回收率比較Fig.1 Recoveries of MOCA by different extraction solvents combination with different purification columns AL:basic Al2O3 column;C18:C18 column;C:carbon column;Ace:acetonitrile;Dich:dichloromethane；added concentration:10.0 ng/mL in blood samples and 5.0 ng/mL in urine samples.

生物樣品中蛋白質(zhì)、有機(jī)鹽類等多種物質(zhì)的存在，對(duì)目標(biāo)物的分離、回收率以及方法的靈敏度影響較大。實(shí)驗(yàn)比較了乙腈、二氯甲烷2種提取方法，其中乙腈提取法回收率更高，但基質(zhì)干擾較大，實(shí)驗(yàn)選擇乙腈沉淀蛋白。進(jìn)一步考察了2倍、5倍、10倍、20倍樣品量乙腈對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀效果，綜合考慮沉淀效果及試劑用量，選擇血液樣品采用10倍樣品量乙腈沉淀蛋白最為理想，尿液樣品采用5倍樣品量乙腈沉淀蛋白。根據(jù)MOCA的特性，分別采用堿性Al2O3柱、C18柱、碳黑柱3種小柱進(jìn)行凈化，結(jié)果表明C18柱凈化效果最好，目標(biāo)物回收率最高。實(shí)驗(yàn)選取乙腈沉淀提取法，結(jié)合C18柱凈化作為生物樣品中MOCA的前處理方法。不同提取方法結(jié)合不同凈化柱的回收率比較見(jiàn)圖1。

2.3 方法的線性范圍及檢測(cè)限

采用空白血液和尿液基質(zhì)溶液配制MOCA分別為0.3、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按優(yōu)化條件處理和測(cè)定，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，MOCA質(zhì)量濃度(x,ng/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，根據(jù)信噪比(S/N≥3)確定方法檢測(cè)限。測(cè)定血液及尿液樣品中MOCA的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢測(cè)限見(jiàn)表2。

2.4 方法的回收率和精密度

選用不含待測(cè)組分的血液及尿液樣品，血液按1.0、10.0、100.0 ng/mL濃度，尿液按0.5、5.0、50.0 ng/mL濃度水平進(jìn)行加入回收試驗(yàn)，每個(gè)添加濃度水平平行測(cè)定6次，回收率和精密度(RSD)見(jiàn)表3。

2.5 實(shí)際樣品分析

采用優(yōu)化條件對(duì)湖南省婦幼保健院100例健康體檢血液及尿液樣品進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出MOCA殘留，同時(shí)對(duì)空白樣品進(jìn)行加入回收試驗(yàn)，實(shí)際血液樣品及空白添加樣品的色譜圖如圖2所示。

表2 MOCA的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)與檢測(cè)限Table 2 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients and limits of detection of MOCA

表3 MOCA的回收率和精密度Table 3 Recoveries and relative standard deriations(RSDs) of MOCA

圖2 實(shí)際樣品(a)及空白添加樣品(b)的色譜圖 Fig.2 Chromatograms of real sample (a) and blank added samples (b) a:blank bood sample;b:blood sample added with 10 ng/mL MOCA.

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)樣品前處理方法、色譜及質(zhì)譜測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了血液和尿液2種生物樣品中MOCA的快速檢測(cè)方法。該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，樣品前處理方法簡(jiǎn)便，血液和尿液樣品的檢測(cè)限分別可以達(dá)到0.5 ng/mL、0.3 ng/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報(bào)道的毒理實(shí)驗(yàn)水平，適用于MOCA高危人群的健康風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)，為健康效應(yīng)和環(huán)境效應(yīng)評(píng)價(jià)提供技術(shù)基礎(chǔ)。