張姜琳，聶福平，楊　俊，李應(yīng)國，肖進(jìn)文，蔡家利，袁增壯，葉自霞，王國民，王　昱，*

（1.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，重慶 400020；2.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054；3.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400716）

牛乳制品中青霉素酶Alphalisa的檢測方法

張姜琳1，2，聶福平1，楊俊1，李應(yīng)國1，肖進(jìn)文1，蔡家利2，袁增壯3，葉自霞3，王國民1，王昱1，*

（1.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，重慶 400020；2.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054；3.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400716）

建立牛乳制品中青霉素酶Alphalisa的檢測方法。將青霉素酶進(jìn)行生物素化，與樣品中的青霉素酶競爭結(jié)合鼠源性青霉素酶單克隆抗體，利用Alphalisa反向競爭的反應(yīng)模式，對牛乳中的青霉素酶實(shí)施檢測。建立的Alphalisa檢測方法能特異性識(shí)別樣品中存在的青霉素酶，方法的線性范圍在2.5～500 IU/mL；檢出限和定量限分別為1.6 IU/mL和5 IU/mL；批間批內(nèi)變異度均小于10%。結(jié)果表明，該方法能夠替代傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法，成為青霉素酶的實(shí)驗(yàn)室篩查或檢測方法。

青霉素酶；Alphalisa檢測；牛乳制品

長期以來，由于價(jià)格低廉，療效確切，青霉素常作為治療奶牛乳腺炎的首選藥物［1］。然而，青霉素的濫用導(dǎo)致牛乳中的青霉素殘留已經(jīng)成為廣大消費(fèi)者關(guān)注的重點(diǎn)［2］。隨著國家對乳及乳制品抗生素殘留監(jiān)管力度的增加，一些不法商販在牛乳中非法添加青霉素酶，以降解牛乳中殘留的青霉素，進(jìn)而促生了青霉素酶的添加和殘留問題［3］。青霉素酶屬于β-內(nèi)酰胺酶，可水解青霉素類的β-內(nèi)酰環(huán)，使青霉素水解為青霉噻唑酸［4］。青霉噻唑酸可與T細(xì)胞表面組織相容性復(fù)合物或與鑲嵌在細(xì)胞膜內(nèi)的多肽結(jié)合，所形成的復(fù)合物激發(fā)T細(xì)胞，從而引起過敏反應(yīng)［5］。更為嚴(yán)重的是，青霉素酶的使用可導(dǎo)致青霉素的濫用，可能導(dǎo)致大量耐藥菌株的產(chǎn)生，嚴(yán)重威脅人類及動(dòng)物的安全健康［6］。衛(wèi)生部于2011年4月19日在《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單（第1-5批匯總）》中明確指出β-內(nèi)酰胺酶列為非食用物質(zhì)，在食品中添加β-內(nèi)酰胺酶屬于違法行為［7］。由此，對牛乳制品中青霉素酶的檢測具有重要的意義。

現(xiàn)有的青霉素酶的檢測方法有碘量法［8］、酸度法［9］、高效液相色譜法［10］、酶聯(lián)免疫法［11］、頭孢硝噻吩顯色法［12］以及杯碟法［13］等。碘量法是《中國藥典》中規(guī)定的檢測β-內(nèi)酰胺酶活性的方法，該法方便快捷、檢出限高。張鑫瀟等［14］采用本法得出的檢出限為12.3 U/mL，但已被認(rèn)為重復(fù)性不好［12］。酸度法操作簡單，檢出限高。劉姍姍等［9］采用酸度法得出的檢出限為8.92 U/mL，王國紅等［15］得出的檢出限為10 IU/mL。酸度法檢測時(shí)間短，但易受溫度等外界環(huán)境干擾。高效液相色譜儀器成本高，孫漢文［10］、林楠［16］等得出的檢出限均為4 U/mL，但此法的前處理過程復(fù)雜。唐群力等［12］采用頭孢硝噻吩法得出的檢出限為20 U/mL。頭孢硝噻吩法操作簡單、方便快捷，但價(jià)格昂貴，重復(fù)性較差，定量不準(zhǔn)確，假陽性率高。杯碟法是衛(wèi)生部規(guī)定的檢測β-內(nèi)酰胺酶類物質(zhì)的方法，其原理是采用對青霉素類藥物絕對敏感的標(biāo)準(zhǔn)菌株，利用舒巴坦抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性，并加入青霉素作為對照，通過比對加入β-內(nèi)酰胺酶抑制劑與未加入的樣品所產(chǎn)生的抑菌圈的大小來間接測定樣品是否含有β-內(nèi)酰胺酶類藥物。但由于不同廠家對酶活性單位的定義不一，不同的研究者報(bào)告的檢出限差異極大。薛曉晶等［13］測定方法的檢出限為0.5 IU/mL，魏國美［17］測定方法的檢出限為0.005 IU/mL，劉姍姍［18］得出的檢出限為4 U/mL，李錦榮等［19］得出的檢出限為0.004 U/mL，劉芳等［20］得出的檢出限為2.0×10－5～1.6×10－4U/mL。杯碟法盡管有著很高的靈敏度和準(zhǔn)確性，但是操作繁瑣，檢測時(shí)間長。

Alphalisa是基于近距離能量共振的原理發(fā)展起來的，通過抗原抗體的相互作用形成供體微珠-抗原-抗體-受體微珠復(fù)合物，在680 nm波長處的激光作用下發(fā)生熒光共振能力轉(zhuǎn)移，釋放單體氧分子作用于受體微珠，于615 nm波長處出現(xiàn)發(fā)射光波［21］。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附方法相比，Alphalisa具有更高的敏感性、均一性，所需時(shí)間短，無需洗滌等優(yōu)點(diǎn)。目前，該技術(shù)主要應(yīng)用于疫病檢測［22］、藥物殘留檢測［23］和蛋白分子相互作用［24］等研究領(lǐng)域。Mechaly等［25］將Alphalisa技術(shù)應(yīng)用于炭疽芽孢孢子和保護(hù)性抗原的檢測，其中可檢測出孢子106個(gè)/mL，對保護(hù)性抗原的檢出限為10～100 pg/mL。Mcgiven等［22］對牛、山羊、綿羊血清中的布氏桿菌進(jìn)行檢測，其敏感性和特異性很高，敏感性為96%，特異性為98%。He An［26］等使用Alphalisa CYFRA 21-1試劑盒對腫瘤標(biāo)志物CYFRA21-1抗原進(jìn)行檢測，其檢出限為0.08 ng/mL。Chau等［27］運(yùn)用高通量的Alphalisa法測定γ-分泌酶，發(fā)現(xiàn)γ-分泌酶抑制劑可能治療癌癥和其他疾病。Waller等［24］用Alphalisa技術(shù)研究并表明了丙型肝炎病毒編碼的NS5A和環(huán)孢菌素A之間的存在著相互作用。Zhang Yi等［23］使用Alphalisa技術(shù)檢測牛乳、蜂蜜、雞蛋中氯霉素的含量，其靈敏度為0.008 6 ng/mL，檢測范圍為0.009 6～25 ng/mL。但國內(nèi)外還沒有運(yùn)用Alphalisa技術(shù)檢測青霉素酶的相關(guān)報(bào)告。本研究，將青霉素酶進(jìn)行生物素化，結(jié)合采用Alphalisa反向競爭的反應(yīng)模式，對牛乳等乳制品中的青霉素酶實(shí)施檢測。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

青霉素酶（P0389） 美國Sigma公司；Zeba Spin脫鹽柱（89889）、青霉素酶（ab10712） 美國Thermo Scientific公司；青霉素酶抗體（ab12251）、雞抗鼠IgG（ab6706） 英國Abcam公司；ChromaLink? Biotin（B-1001-010） 美國Solulink公司； AlphaScreen? Streptavidin Donor beads（6760002）、AlphaScreen? Unconjugated Acceptor Beads（6762001） 美國Perkinelmer公司。

1.2方法

1.2.1抗原的純化及生物素化

抗原的純化：將青霉素酶溶解于修飾緩沖液（100 mmol/L磷酸鈉、150 mmol/L NaCl、pH 8.0）中，用Zeba Spin脫鹽柱進(jìn)行液體交換和脫鹽凈化。凈化過程：取出低溫保存的脫鹽柱，回復(fù)室溫，去掉脫鹽柱底端封口帽，開蓋，將柱子放入收集管中。4 ℃、1 500 r/min離心2 min，去除保存液。向柱子中加入合適體積的待交換溶液，洗柱，4 ℃、1 000 r/min離心2 min，重復(fù)2～3次。將柱子放入新的收集管中，慢慢將適量的樣品注入樹脂的中心位置。5 mL的柱子上樣量為500～2 000 μL。4 ℃、1 000 r/min離心2 min，收集樣品。A280nm測定蛋白質(zhì)量濃度，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，確定蛋白的相對分子質(zhì)量。

青霉素酶的生物素化：用修飾緩沖液將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整到1～2 mg/mL。計(jì)算抗原和生物素化試劑的比例，取53 μL脫鹽后的抗原溶液加入4.6 μL的Chromalink Biotin的二甲基甲酰胺溶液（取1 mg Chromalink Biotin加入100 μL無水二甲基甲酰胺中即成）中，室溫條件下結(jié)合90 min。同前進(jìn)行脫鹽，也交換緩沖體系為Alphalisa檢測緩沖液（含25 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，0.5%聚乙二醇辛基苯基醚，0.1%干酪素，1 mg/mL葡聚糖T500，pH 7.4）中，分光光度計(jì)測定A280nm和A354nm的值，計(jì)算摩爾替換比率（molar substitution ratio，MSR）。

1.2.2受體磁珠偶聯(lián)抗鼠IgG

取5～50 μL（20 mg/mL）的受體磁珠于1.5 mL的離心管中，加入50 μL的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4），14 000 r/min離心15 min，去上清液?，F(xiàn)配400 mmol/L NaBH3CN溶液，然后按照每5 μL受體磁珠和10 μL抗小鼠IgG抗體（1 mg/mL）、1 μL NaBH3CN、0.125 μL的10%吐溫20以及3.875 μL的HEPES Buffer 37 ℃輕柔振蕩反應(yīng)18～24 h。然后加入10 μL 65 mg/mL的CMO溶液（用800 mmol/L的NaOH溶液現(xiàn)配現(xiàn)用），37 ℃，輕柔振蕩反應(yīng)1 h。然后4 ℃、14 000 r/min離心15 min，去上清液，然后加 入200 ?L的100 mmol/L Tirs-HCl（pH 8.0）重懸磁珠。隨即進(jìn)行10 次超聲振蕩（每次1 s），4 ℃、14 000 r/min離心15 min，去上清液。然后加入Tirs-HCl（pH 8.0）溶液，同前進(jìn)行第二次超聲，離心，去上清液，加200 μL的PBS（含0.05%的Proclin-300），渦旋振蕩，同前簡短超聲，避光保存。

1.2.3Alphalisa檢測和優(yōu)化

檢測反應(yīng)體系采用反向競爭模式，檢測過程均在室溫條件下完成，具體操作如下：取青霉素酶溶解于檢測緩沖液中，然后取5 μL該溶液和等體積的抗青霉素酶單克隆抗體反應(yīng)1 h，形成抗原抗體復(fù)合物；然后加入5 μL生物素化青霉素酶反應(yīng)0.5 h，競爭結(jié)合游離的抗青霉素酶單抗；接著加入各5 μL的抗鼠IgG包被受體磁珠工作液和鏈親和素供體磁珠工作液，避光反應(yīng)0.5 h，最終形成如圖1所示的供體磁珠-生物素化青霉素酶-抗青霉素酶單抗-受體磁珠復(fù)合物。最后，在ENspire multimode reader的Alphalisa檢測模塊中，以680 nm波長處的入射光下發(fā)生熒光共振能力轉(zhuǎn)移，單體氧傳遞到受體磁珠上，同步激發(fā)波長615 nm的發(fā)射光，記錄反應(yīng)的信號(hào)值。

圖1　研究采用的反向競爭Alphalisa反應(yīng)模式Fig.1　Revers competition Alphalisa used in this study

優(yōu)化試驗(yàn)，首先將抗體1（ab 12251）和抗體2（ab 10712）分別稀釋3 個(gè)濃度梯度：5、20 nmol/L和60 nmol/L，其他條件固定：供體及受體磁珠質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，然后和濃度為60 nmol/L的生物素化青霉素酶進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)的具體效果選擇抗原抗體反應(yīng)對?？乖贵w對固定后，分別梯度稀釋生物素化抗原（400、133、80、57 nmol/L和44 nmol/L）和抗體的濃度（67、22、13 nmol/L和10 nmol/L），同時(shí)固定其他反應(yīng)條件，測試不同濃度條件下的反應(yīng)效果。最后，分別梯度稀釋供體磁珠以及受體磁珠的質(zhì)量濃度（20、40、80、100、160 μg/mL和200 μg/mL），固定其他反應(yīng)條件交叉反應(yīng)，選擇最佳的磁珠工作質(zhì)量濃度。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限、線性范圍和特異性的確定

選取和待測樣品相同基質(zhì)的無青霉素酶樣品為原料，用等量的檢測緩沖液溶解后，12 000 r/min離心取上清液，用0.45 μm濾器過濾后作為標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋溶液。用不同基質(zhì)稀釋液將青霉素酶標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為5 000、 500、250、50、25、5、2.5、1 IU/mL和0 IU/mL作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的備用點(diǎn)，每個(gè)梯度分別取5 μL和抗體反應(yīng)1 h，然后加入5 μL生物素化青霉素酶反應(yīng)0.5 h，然后加入各5 μL的抗鼠IgG包被受體磁珠工作液和鏈親和素供體磁珠工作液，避光反應(yīng)0.5 h。最后，在ENspire multimode reader的Alphalisa模塊中檢測，記錄反應(yīng)的信號(hào)值。以相對熒光值為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，做散點(diǎn)圖，并以線性回歸擬合曲線，得到不同樣品類型的標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。檢出限以0添加水平的平均測定值計(jì)算；定量限以線性回歸曲線中能定量的最低濃度點(diǎn)計(jì)算。

為了驗(yàn)證方法的特異性，將青霉素酶、明膠、甘氨酸、酪蛋白、胰酶、葡聚糖、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶以及乳清蛋白用檢測緩沖液溶解為500 nmol/L的濃度，取5 μL同上檢測，同時(shí)用空白檢測緩沖液為陰性對照。

1.2.5添加回收實(shí)驗(yàn)和可重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

為了分析方法在不同基質(zhì)條件下的檢測能力，分別選取殺菌乳、滅菌乳、發(fā)酵型酸乳、配方奶粉、復(fù)原乳和脫脂奶粉進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)。每種基質(zhì)添加250、100、50 IU/mL和5 IU/mL 4 個(gè)水平，每個(gè)水平分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)，每次重復(fù)數(shù)為3。標(biāo)準(zhǔn)曲線同前制備?？芍貜?fù)性用批內(nèi)和批間重復(fù)的變異系數(shù)表示。

1.2.6樣品的檢測

從本地不同超市，采購殺/滅菌乳16 份、發(fā)酵型酸乳16 份、配方奶粉16 份、復(fù)原乳16 份和脫脂奶粉12 份。樣品同時(shí)用杯碟法［28］和Alphalisa法進(jìn)行檢測。杯碟法檢測時(shí)，牛乳樣本的處理，對于不同的乳制品可能會(huì)略微不同，固態(tài)乳和半固體乳都要先做溶解和稀釋，成液態(tài)后高速離心取上清 再經(jīng)0.45 μm濾膜過濾一下。檢測結(jié)果均以檢出和未檢出進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和比較。

2　結(jié)果與分析

2.1青霉素酶的生物素化和磁珠的抗體偶聯(lián)

生物素化的青霉素酶在A280nm和A354nm處均有強(qiáng)烈吸收，而未生物素化的青霉素酶只在A280nm處有吸收。計(jì)算得知，蛋白質(zhì)量濃度約為0.2 mg/mL，MSR值約為在3.6，批次間略有差異。生物素化的效率常常受到來自樣品組成的影響。通常情況下，樣品質(zhì)量濃度越高，生物素化的效率會(huì)更高；樣品中不能含有自由氨基的其他雜質(zhì)或雜蛋白，譬如Tris、甘氨酸等。此外，樣品的度也嚴(yán)重影響生物素化的效率，若蛋白發(fā)生了降解，生物素化的過程將嚴(yán)重受到阻礙。受體磁珠偶聯(lián)抗小鼠IgG抗體同樣受到蛋白質(zhì)量濃度的影響。聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明如圖2所示，經(jīng)過柱子純化的生物素化的青霉素酶純度高，沒有其他雜蛋白存在。在高質(zhì)量濃度下，抗體容易偶聯(lián)并飽和受體磁珠，在低濃度下抗體極難和受體磁珠結(jié)合。試驗(yàn)中是采取逐步測定偶聯(lián)上清液中未結(jié)合的抗體濃度，加以反向推算偶聯(lián)的IgG濃度，經(jīng)計(jì)算偶聯(lián)磁珠和IgG的分子比在1∶1 000～1∶1 500之間。

圖2　2青霉素酶十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.2　SDS-PAGE of penicillinase

2.2Alphalisa檢測和優(yōu)化

經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)體系為反向競爭模式，樣品中的青霉素酶和抗體相互作用形成復(fù)合物，再加入已知濃度的生物素化青霉素酶競爭尚未形成復(fù)合物的游離抗體。加入抗鼠IgG包被受體磁珠和鏈親和素供體磁珠后，若樣品中青霉素酶的濃度范圍適當(dāng)，將形成生物素化青霉素酶和游離抗體為核心的復(fù)合物，出現(xiàn)反應(yīng)信號(hào)。若樣品中沒有青霉素酶，信號(hào)值出現(xiàn)飽和，若樣品中存在青霉素酶，抗體將被完全結(jié)合，從而生物素化青霉素酶無法形成復(fù)合物，檢測信號(hào)達(dá)到最低值。實(shí)驗(yàn)表明，反應(yīng)中的抗原抗體對的選擇和抗原和抗體的反應(yīng)濃度是最為關(guān)鍵的要素。如表1所示，抗體ab12251在各水平的檢測值均高于抗體ab10712，由此選擇抗體ab12251作為檢測反應(yīng)的抗體；如表2顯示，隨著抗原抗體濃度的遞增，檢測反應(yīng)值梯度升高，但是在生物素化抗原濃度為133 nmol/L和400 nmol/L時(shí)出現(xiàn)了明顯的拐點(diǎn)，考慮到生物素化抗原的量不易獲得的情況，選擇反應(yīng)值在20460時(shí)的抗原抗體濃度作為優(yōu)化的反應(yīng)濃度；供體磁珠和受體磁珠的質(zhì)量濃度均為100 μg/mL時(shí)信號(hào)值達(dá)到峰值，見表3。優(yōu)化后的檢測體系如下：取適量樣品溶解于檢測緩沖液中，然后取5 μL該樣品溶液和等體積的22 nmol/L抗青霉素酶單克隆抗體（ab12251）反應(yīng)1 h，然后加入5 μL 133 nmol/L生物素化青霉素酶反應(yīng)0.5 h，然后加入各5 μL的抗鼠IgG包被受體磁珠工作液（100 μg/mL）和鏈親和素供體磁珠工作液（100 μg/mL），避光反應(yīng)0.5 h。最后，在ENspire multimode reader的Alphalisa模塊中檢測，記錄反應(yīng)的檢測信號(hào)值。整個(gè)過程不需要洗板，時(shí)間為2 h。

表1　抗原-抗體反應(yīng)對的選擇Table1　The selection of Antigen-antibody reaction

表2　抗原-抗體反應(yīng)濃度的優(yōu)化Table2　The optimization of the concentrations of antibody and antigen

表3　供體-受體磁珠工作濃度優(yōu)化Table3　Optimization of the working concentrations of donatoracceptor beads

2.3方法的檢測特征值

由于不同基質(zhì)對反應(yīng)的影響能力差異較大，因此標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備采用針對不同樣品來制備。當(dāng)樣品溶解于檢測緩沖液后，經(jīng)過離心，去掉不溶物和脂肪，再過濾，除去大顆粒的干擾物，更有利于檢測反應(yīng)的進(jìn)行。通過多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)，取青霉素酶標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為500、250、50、25、5、2.5 IU/mL 6 個(gè)點(diǎn)獲得最佳線性范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以相對熒光值（Bx/B0）為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的濃度（C）的對數(shù)值（lgC）為橫坐標(biāo)，而得到該類樣品中的最佳標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。

通過以不同性質(zhì)青霉素酶陰性樣品的標(biāo)準(zhǔn)添加實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，方法對空白檢測緩沖液的響應(yīng)最為靈敏，表現(xiàn)為相同水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率更大（k=0.326）。不同性質(zhì)的乳品均表現(xiàn)為含有反應(yīng)抑制物，因此針對不同基質(zhì)樣品的檢測，需要以相應(yīng)的陰性樣品作基質(zhì)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢出限以0添加水平的平均測定值計(jì)算，其中脫脂乳粉檢出限最高，酸乳最低，結(jié)果見表4；定量限以線性回歸曲線中能定量的最低濃度點(diǎn)計(jì)算，本方法對脫脂奶粉、復(fù)原乳、殺菌乳、滅菌乳、酸乳以及配方奶粉的檢測定量限為5 IU/mL。在方法的特異性驗(yàn)證中，只有在添加青霉素酶時(shí)，有檢測信號(hào)，說明方法特異性好，見表5。

圖3　各基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　Standard curve different kinds of milk

表4　不同類型乳品中的檢出限和定量限Table4　Limits of detection （LOD） and limits of quantitation （LOQ） in different kinds of milk

表5　檢測方法的特異性Table5　Specificity of the assay

2.4添加回收實(shí)驗(yàn)和可重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

青霉素酶在不同基質(zhì)中均有良好的回收效果?？傮w上，中等水平的添加回收率較好，較高或較低水平的添加回收率較差，且在各個(gè)添加水平均滿足青霉素酶快速檢測的要求，見表6。檢測方法在批內(nèi)和批間的變異度均在10%以內(nèi)。

表6　檢測方法的回收率Table6　Recovery rates of the assay

2.5樣品的檢測

在所有檢測的樣品中，經(jīng)杯碟法檢出6 份，其余均為陰性。經(jīng)Alphalisa法檢出10 份，其中包括杯碟法［28］檢出的6 份，見表7。相對于杯碟法，Alphalisa法檢出率高出3.9%。2 種方法檢出的陽性樣品主要為殺菌乳和滅菌乳，酸乳、復(fù)原乳以及乳粉中青霉素酶檢出率較低。原因可能是，在所有樣品中，以殺菌乳和滅菌乳的黏稠度最低，樣品更容易處理。結(jié)果表明Alphalisa法在檢測靈敏度方面高于傳統(tǒng)的杯碟法，檢測的準(zhǔn)確度和杯碟法相當(dāng)。

表7　杯碟法與Alphalisa樣品檢出對比Table7　Contrast in the detection of samples between cylinder plate method and Alphalisa

3　結(jié) 論

青霉素酶的殘留給乳制品的質(zhì)量安全帶來了極大的危害。將Alphalisa檢測方法應(yīng)用于青霉素酶的檢測主要的挑戰(zhàn)是基質(zhì)樣品的復(fù)雜性。在Mechaly等［25］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Alphalisa法可以克服基質(zhì)樣本的復(fù)雜性。該研究將Alphalisa方法應(yīng)用于環(huán)境樣品中炭疽孢子的檢測，靈敏度達(dá)到106孢子/mL。本研究的結(jié)果也表明，不同的牛乳制品對反應(yīng)均有一定程度的抑制，但是通過離心、過濾的處理后，都能在一定的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性反應(yīng)規(guī)律。由于Alphalisa檢測反應(yīng)一直處于均相的液體環(huán)境下反應(yīng)，檢測限低于常規(guī)的同類方法。由于沒有洗板的過程，Alphalisa檢測的時(shí)間大大縮短，比常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附方法縮短1～2 h。由此可見，Alphalisa方法在復(fù)雜樣品中進(jìn)行快速、高靈敏度的檢測能力極強(qiáng)，有望成為常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附方法的替代方法。

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Establishment of the Alphalisa Method for the Detection of Penicillinase in Milk Products

ZHANG Jianglin1，2， NIE Fuping1， YANG Jun1， LI Yingguo1， XIAO Jinwen1， CAI Jiali2，YUAN Zengzhuang3， YE Zixia3， WANG Guomin1， WANG Yu1，*
（1. Technical Center， Chongqing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Chongqing 400020， China；2. Institute of Pharmacy and Bioengineering， Chongqing University of Technology， Chongqing 400054， China；3. College of Animal Science and Technology， Southwest University， Chongqing 400716， China）

Penicillinase is one of the rick drugs present in milk products. In this article， the standard penicillinase was biotinylated， and competitively bound to mouse anti-penicillinase monoclonal antibodies by reverse competitive Alphalisa. The established Alphalisa detection method was shown to specifically identify penicillinase present in the samples. The variations between batches were less than 10%， with the limit of detection and the limit of quantitation of 1.6 IU/mL and 5 IU/mL， respectively， and the linearity range of 2.5-500 IU/mL. The results show that this method can replace the traditional ELISA method as a laboratory screening or detection method for penicillinase.

penicillinase； alphalisa detection； milk products

R155.5

A

1002-6630（2015）14-0181-06

10.7506/spkx1002-6630-201514035

2014-10-07

重慶市科技攻關(guān)項(xiàng)目（2014yykfA80017；2010GGC239）；國家質(zhì)檢總局質(zhì)檢項(xiàng)目（2012IK029）

張姜琳（1986—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橐呙缂翱贵w藥物。E-mail：396436920@qq.com

王昱（1982—），男，高級(jí)獸醫(yī)師，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物源食品安全。E-mail：cqciqwangyu@gmail.com