王小勇，陶承軍，任金平，袁丞達(dá)，王敏磊，應(yīng)航宇

（杭州市中醫(yī)院　皮膚科，浙江　杭州　310007）

水通道蛋白在光化性角化病、Bowen病和浸潤性鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義

王小勇，陶承軍，任金平，袁丞達(dá)，王敏磊，應(yīng)航宇

（杭州市中醫(yī)院皮膚科，浙江杭州310007）

目的：探討水通道蛋白（AQP）1、3、9、10在光化性角化?。ˋK）、Bowen?。˙D）和浸潤性皮膚鱗狀細(xì)胞癌（SCC）中的表達(dá)及其意義。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測AQP1、AQP3、AQP9、AQP10在人正常皮膚組織、AK、BD和浸潤性SCC中的表達(dá)情況。結(jié)果：與正常皮膚組織比較，AQP3、AQP9和AQP10表達(dá)在AK、BD和浸潤性SCC中均顯著增高；AQP1在浸潤性SCC的血管內(nèi)膜和血管內(nèi)皮細(xì)胞中強(qiáng)度染色；浸潤性SCC 中AQP9、AQP10的表達(dá)水平顯著高于AK。結(jié)論：AQP1、AQP3、AQP9、AQP10的表達(dá)上調(diào)與浸潤性SCC的發(fā)生、發(fā)展可能相關(guān)。

水通道蛋白；光化性角化??；Bowen病；鱗狀細(xì)胞癌

水通道蛋白（aquaporin，AQP），又名水乳蛋白，是一類介導(dǎo)水分子跨膜運(yùn)動的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的總稱，其在細(xì)胞膜上組成“孔道”，可控制水在細(xì)胞的進(jìn)出。研究發(fā)現(xiàn)，在人皮膚中共有6種亞型的AQP表達(dá)，分別是AQP1、AQP3、AQP5、AQP7、AQP9和AQP10，其中在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)的有AQP1、AQP3、AQP9、AQP10［1］。AQP和各種腫瘤間的關(guān)系是近年來的研究熱點(diǎn)。研究表明AQP與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［2］。本研究檢測AQP1、AQP3、AQP9、AQP10在光化性角化?。╝ctinic keratosis，AK）、Bowen?。˙owen’s disease，BD）和浸潤性皮膚鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）中的表達(dá)水平，并初步探討AQP1、AQP3、AQP9、AQP10的表達(dá)在AK、BD和浸潤性SCC發(fā)生和發(fā)展中的作用及意義。

1　材料和方法

1.1標(biāo)本來源 收集AK病理標(biāo)本12例，其中面部9例，手背2例，小腿1例，年齡（79.86±8.09）歲；BD病理標(biāo)本15例，其中軀干9例，四肢6例，年齡（71± 6.51）歲；SCC病理標(biāo)本20例，其中面部4例，頭皮3例，軀干3例，四肢10例，年齡（67.67±14.04）歲，根據(jù)Broders分級法，I級10例，I I級4例，I I I級4例，IV級2例，均未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。對照的正常皮膚組

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色：新鮮正常皮膚組織及腫瘤組織用4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。石蠟切片制作流程：修塊、沖洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、烤片、保存。免疫組織化學(xué)染色步驟：二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3% H2O2阻斷和滅活內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復(fù)，正常羊血清工作液封閉，加一抗過夜，加二抗，加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶，DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，干燥，封片。以正常皮膚作對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.2結(jié)果判斷：細(xì)胞膜、細(xì)胞漿或/和細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒判定為陽性細(xì)胞。參照Ozdemir等［3］的評分標(biāo)準(zhǔn)，按染色強(qiáng)度及染色細(xì)胞比例進(jìn)行評分。按染色強(qiáng)度評分為：輕度染色（淡黃色）為1，中度染色（棕黃色）為2，強(qiáng)度染色（棕黑色）為3。按陽性細(xì)胞比例評分為：陽性細(xì)胞＜1/3 為l，1/3～2/3為2，＞2/3為3。染色強(qiáng)度得分與陽性細(xì)胞比例得分相乘為最后得分。1～3分為弱陽性（+），4～6分為陽性（++），7～9分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSSl2.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以Mann-Whitney U檢驗(yàn)比較各組間蛋白表達(dá)水平。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1AQP1、AQP3、AQP9、AQP10在正常皮膚及AK、BD和浸潤性SCC中的表達(dá)情況 AQP1在正常皮膚的角質(zhì)層和表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中為弱陽性表達(dá)，在表皮中上層表達(dá)更明顯，在角質(zhì)形成細(xì)胞中主要為胞膜和胞漿染色（見圖1a）。AQP1在AK、BD和浸潤性SCC中均為弱陽性表達(dá)，與正常皮膚不同的是部分異型細(xì)胞核輕度染色（見圖1b-d）。AQP1在正常真皮的血管內(nèi)膜中為輕度染色或不染色，AQP1在AK和BD真皮的血管內(nèi)膜中為中度至強(qiáng)度染色，在浸潤性SCC腫瘤團(tuán)塊間的血管內(nèi)膜中為強(qiáng)度染色（見圖1a-d）。

AQP3在正常皮膚的角質(zhì)形成細(xì)胞中為弱陽性表達(dá)，在表皮中下層表達(dá)更明顯，主要為胞膜染色，部分胞漿淡染（見圖2a）。AQP3在AK和BD中為陽性表達(dá)，主要為胞膜染色，部分為胞漿染色（見圖2b-c）。在BD中，部分異型細(xì)胞核亦染色陽性。在浸潤性SCC的癌珠及癌巢處為強(qiáng)陽性表達(dá)，主要為胞膜染色（見圖2d）。AQP3在正常皮膚、SK、BD和浸潤性SCC的血管內(nèi)膜中均為陰性表達(dá)。

圖1　AQP1的表達(dá)情況（SP法，×200）

圖2　AQP3的表達(dá)情況（SP法，×200）

AQP9在正常皮膚的角質(zhì)形成細(xì)胞中為弱陽性表達(dá)，主要為胞漿染色，部分胞核染色（見圖3a）。AQP9在AK和BD中陽性表達(dá)，主要為胞核染色，部分胞漿染色（見圖3b-c）。AQP9在浸潤性SCC中為強(qiáng)陽性表達(dá)，所有細(xì)胞均染色，主要為胞核染色，部分胞漿染色（見圖3d）。AQP9在正常皮膚、SK、BD和浸潤性SCC的血管內(nèi)膜中均為陰性表達(dá)。

AQP10在正常皮膚的角質(zhì)形成細(xì)胞中為弱陽性表達(dá)，主要為胞核染色，胞漿淡染（見圖4a）。AQP10 在AK中陽性表達(dá)，主要為胞核染色，胞漿淡染（見圖4b）。AQP10在BD和浸潤性SCC中為強(qiáng)陽性表達(dá)，主要為胞核染色，胞漿淡染（見圖4c-d）。AQP10在正常皮膚、SK、BD和浸潤性SCC的血管內(nèi)膜中均為陰性表達(dá)。

圖3　AQP9的表達(dá)情況（SP法，×200）

圖4　AQP10的表達(dá)情況（SP法，×200）

2.2AQP1、AQP3、AQP9、AQP10在正常皮膚及AK、BD和浸潤性SCC中的差異表達(dá) AQP1在AK、BD和浸潤性SCC中為弱陽性表達(dá)，與正常皮膚組織比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。AK、BD和浸潤性SCC的癌珠及癌巢中AQP3的表達(dá)水平均顯著高于正常表皮（Z值分別為4.175、4.369、4.813，均P＜0.01）。AK、BD和浸潤性SCC中AQP9的表達(dá)水平均顯著高于正常表皮（Z值分別為4.195、4.533、4.678，均P＜0.01），浸潤性SCC中AQP9的表達(dá)水平顯著高于AK和BD（Z值分別為3.756、3.718，均P＜0.01）。AK、BD和浸潤性SCC中AQP10的表達(dá)水平均顯著高于正常表皮（Z值分別為4.179、4.371、4.751，均P＜0.01），浸潤性SCC和BD中AQP10的表達(dá)水平顯著高于AK（Z值分別為4.208、3.661，均P＜0.01）。見表1。

表1　AQP1、AQP3、AQP9、AQP10在正常皮膚及AK、BD和浸潤性SCC中的表達(dá)

表1　AQP1、AQP3、AQP9、AQP10在正常皮膚及AK、BD和浸潤性SCC中的表達(dá)

與正常皮膚比：aP＜0.01；與AK比：bP＜0.01；與BD組比：cP＜0.01

組別　n　AQP1　AQP3　AQP9　AQP10正常皮膚　10　2.20±0.42　2.10±0.57a　2.10±0.32abc　2.3±0.48aaAK　12　2.17±0.58　5.50±0.91a　5.33±0.99abc　5.0±1.05aaBD　15　2.27±0.59　5.33±0.98a　5.47±0.92abc　7.6±1.55ab浸潤性SCC　20　2.30±0.57　5.60±0.82a　7.05±1.47abc　7.2±1.51ab

3　討論

皮膚SCC在臨床上很常見，治療的關(guān)鍵在于早期發(fā)現(xiàn)和早期治療，所以診斷和鑒別皮膚癌前病變、原位癌和浸潤性SCC對于選擇治療方案和預(yù)后都至關(guān)重要。AK是癌前期疾病，有0.01%～0.30%的可能轉(zhuǎn)變?yōu)榻櫺許CC。BD，即原位鱗狀細(xì)胞癌，約3%～5%的患者，也有認(rèn)為高達(dá)20%～30%的患者可發(fā)展成為浸潤性SCC。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測了正常皮膚及AK、BD和浸潤性SCC中AQP1、AQP3、AQP9、AQP10的表達(dá)情況，并且比較了它們之間的表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AQP3、AQP9和AQP10表達(dá)在AK、BD和浸潤性SCC中均顯著增高；AQP1在AK和BD真皮的血管內(nèi)膜中為中度至強(qiáng)度染色，在浸潤性SCC腫瘤團(tuán)塊間的血管內(nèi)膜中為強(qiáng)度染色；浸潤性SCC中AQP9的表達(dá)水平顯著高于AK和BD；浸潤性SCC和BD中AQP10的表達(dá)水平顯著高于AK。以上結(jié)果表明，這些AQP的差異表達(dá)與浸潤性SCC的發(fā)生、發(fā)展可能相關(guān)。

AQP1是近年來與腫瘤關(guān)系研究中的一個(gè)熱點(diǎn)蛋白。研究表明，AQP1能促進(jìn)腫瘤的局部浸潤、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移［2］。AQP1還與腫瘤的新生血管形成有關(guān)，缺少AQP1時(shí)，腫瘤的生長和新生血管形成明顯降低［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，AQP1在浸潤性SCC的血管內(nèi)膜和血管內(nèi)皮細(xì)胞中強(qiáng)度染色，明顯高于在正常皮膚中的表達(dá)水平，亦高于在AK和BD真皮中的表達(dá)水平，說明隨著SCC的發(fā)展，當(dāng)真皮中有腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、增殖和新生血管形成時(shí)，AQP1在血管內(nèi)膜和血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)是明顯增加的，這表明AQP1確實(shí)與浸潤性SCC的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散和新生血管形成有關(guān)系，但其中具體的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。因此，當(dāng)判斷皮膚SCC在真皮中是否有轉(zhuǎn)移及擴(kuò)散有困難時(shí)，用免疫組織化學(xué)方法檢測AQP1在真皮血管中的表達(dá)水平可能具有重要的意義。

AQP3也是與腫瘤關(guān)系研究中的一個(gè)熱點(diǎn)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，AQP3在SCC中高表達(dá)，而且細(xì)胞分化越低，AQP3的表達(dá)越少［5］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，AQP3主要在浸潤性SCC的癌珠及癌巢處表達(dá)，即在高分化處高表達(dá)，在低分化處低表達(dá)或不表達(dá)，表明AQP3的表達(dá)與SCC的分化有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)AQP3的表達(dá)水平在AK、BD和浸潤性SCC中顯著增高，表明AQP3的高表達(dá)與皮膚SCC的發(fā)生亦相關(guān)。本課題組用siRNA下調(diào)AQP3的表達(dá)可抑制SCC細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)SCC細(xì)胞凋亡，證實(shí)AQP3表達(dá)與皮膚SCC細(xì)胞的增殖和凋亡相關(guān)［6］。研究亦發(fā)現(xiàn)AQP3主要在細(xì)胞膜上表達(dá)，AQP3的高表達(dá)可能通過改變腫瘤細(xì)胞的滲透壓，使腫瘤細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，從而有利于向周圍組織發(fā)生浸潤［7］。

目前關(guān)于AQP9、AQP10與皮膚SCC關(guān)系的研究很少。以往研究發(fā)現(xiàn)，AQP9只在處于分化狀態(tài)的角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，AK、BD和浸潤性SCC中AQP9、AQP10的表達(dá)水平均顯著高于正常表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，而且浸潤性SCC中AQP9、AQP10的表達(dá)水平顯著高于AK，這些結(jié)果提示AQP9、AQP10的表達(dá)與SCC的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。在AQP家族中，AQP3、AQP7、AQP9和AQP10是水-甘油通道蛋白，能轉(zhuǎn)運(yùn)水和甘油。這些AQP的高表達(dá)可能通過轉(zhuǎn)運(yùn)甘油增加，接下來通過腺嘌呤核苷三磷酸/p38絲裂原活化蛋白激酶（ATP/p38 MAPK）信號通路促進(jìn)皮膚腫瘤的發(fā)生［2］。在本研究中，AQP9、AQP10主要在AK、BD和浸潤性SCC的異型胞核中表達(dá)，其具體的意義還有待進(jìn)一步的研究。

［1］Boury-Jamot M， Sougrat R， Tailhardat M， et al. Expression and function of aquaporins in human skin: Is aquaporin-3 just a glycerol transporter？［J］. Biochim Biophys Acta， 2006，1758（8）: 1034-1042.

［2］Verkman AS， Hara-Chikuma M， Papadopoulos MC. Aquaporins—new players in cancer biology［J］. J Mol Med， 2008，86（5）: 523-529.

［3］Ozdemir E， Kakehi Y， Okuno H， et al. Role of matrix metalloproteinase-9 in the basement membrane destruction of superficialurothelial carcinomas［J］. J Urol， 1999， 161（4）: 1359-1363.

［4］Saadoun S， Papadopoulos MC， Hara-Chikuma M， et al. Impairment of angiogenesis and cell migration by targeted aquaporin-1 gene disruption［J］. Nature， 2005， 434（7034）: 786-792.

［5］李吉， 張碧紅， 謝紅付， 等. 水通道蛋白3在四種皮膚腫瘤中的表達(dá)［J］. 中華皮膚科雜志， 2008， 41（11）： 716-718.

［6］王小勇， 陶承軍， 袁丞達(dá)， 等. si RNA干擾水通道蛋白3和磷脂酶D2表達(dá)對A431細(xì)胞株生長和凋亡的影響［J］. 中華皮膚科雜志， 2014， 47（11）： 772-775.

［7］McCoy E， Sontheimer H. Expression and function of water channels （aquaporins） in migrating malignant astrocytes［J］. Glia， 2007， 55（10）: 1034-1043.

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（本文編輯：丁敏嬌）

Expression and significance of aquaporin in actinic keratosis， Bowen’s disease and invasive squamous cell carcinoma

WANG Xiaoyong， TAO Chengjun， REN Jinping， YUAN Chengda， WANG Minlei， YING Hangyu. Department of Dermatology， Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou， 310007

Objective: To explore the expression and significance of aquaporin （AQP） 1， 3， 9， 10 in lesions of actinic keratosis， Bowen’s disease and invasive squamous cell carcinoma. Methods: Immunohistochemistry was utilized to measure the expression of AQP 1， 3， 9， 10 in tissue samples from normal human skin， actinic keratosis， Bowen’s disease and invasive squamous cell carcinoma. Results: The expression of AQP 3， 9， 10 in tissue samples from actinic keratosis， Bowen’s disease and invasive squamous cell carcinoma all increased significantly compared with the normal skin tissue. The high staining of AQP1 was observed in vascular inner membrance and endothelial cells of invasive squamous cell carcinoma. The expression of AOP9 and AQP10 in tissue samples from invasive squamous cell carcinoma increased significantly compared with actinic keratosis. Conclusion: The upregulated expression of AQP1， 3， 9， 10 may correlated with the carcinogenesis and progression of invasive squamous cell carcinoma.

aquaporin； actinic keratosis； Bowen’s disease； squamous cell carcinoma

R758.69

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.12.004

2014-11-13

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY12H11010）。

王小勇（1974-），男，湖南邵陽人，副主任醫(yī)師，博士。織標(biāo)本取自本科室皮膚活檢標(biāo)本邊緣的正常皮膚，共10例，其中面部4例，軀干3例，四肢3例，年齡（73.43±8.49）歲。兔抗人AQP1多克隆抗體購自美國Santa Cruz生物技術(shù)公司，兔抗人AQP3多克隆抗體購自美國Bioworld技術(shù)公司，兔抗人AQP9多克隆抗體購自臺灣Abnova生物技術(shù)公司，兔抗人AQP10多克隆抗體購自香港Abcam公司，SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。