王丹妮+劉軍

摘 要：研究運(yùn)用SMART技術(shù)對藍(lán)點(diǎn)馬鮫頭腎構(gòu)建了cDNA文庫，該文庫原始文庫滴度為2.26×106pfu/mL，文庫容量為1.36×106pfu，符合文庫構(gòu)建的要求。從文庫中隨機(jī)挑選24個(gè)單克隆菌，以載體的通用引物進(jìn)行菌落檢測PCR，結(jié)果表明：重組率為95.8%，插入片段大小平均為1 000bp。該文庫的構(gòu)建滿足了基因的分離與篩選，為進(jìn)一步研究其相關(guān)基因克隆及分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：藍(lán)點(diǎn)馬鮫；頭腎；cDNA文庫；構(gòu)建

中圖分類號 Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）17-36-03

Construction of cDNA Libraries and Identification of Head Kidney from Scomberomorus niphonius

Wang Danni et al.

（China filiang university，HangZhou 310018，China）

Abstract：cDNA library of Scomberomorus niphonius head kidney was constracted by SMART technology.The original library titer is 2.26×106pfu/mL，and library capacity is 1.36×106pfu，meeting the requirements of library construction. RandomLy selected 24 monoclonal bacteria from the library，subjected to colony PCR detected by using universal primers. The results showed that recombination rate was 95.8%，an average insert size was 1 000bp. Construction of the library meet the isolation and screening of gene，and lay the foundation for further study of melecμlar biology and gene cloning.

Key words：Scomberomorus niphonius；Head kidney；cDNA library；Construction

目前，分離基因最快、最有效的技術(shù)是cDNA文庫的構(gòu)建。cDNA文庫是一種重組的克隆基因群，是以組織中的mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成的互補(bǔ)DNA，并與適當(dāng)?shù)妮d體（常用噬菌體或質(zhì)粒載體）連接轉(zhuǎn)化而形成的，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織或細(xì)胞的cDNA文庫[1]。與其他文庫相比，cDNA文庫中獲得的基因組是已經(jīng)剪切將內(nèi)含子去除的cDNA，因此可以在cDNA文庫中便捷地獲取基因序列的信息[2]。

藍(lán)點(diǎn)馬鮫（Scomberomorus niphonius）屬于輻鰭亞綱、鱸形目，鯖亞目、鯖科、馬鮫屬，普遍分布于北太平洋的西邊以及中國東海、黃海、渤海及南海（以海南文昌鋪前附近海域最為著名）等地。該魚體長而扁平，紡錘形，是北方海經(jīng)濟(jì)魚類。在硬骨魚的體內(nèi)存在著頭腎，位置在全腎的最前端，這個(gè)部位屬于淋巴組織，具有免疫的功能，可以制造白血球以及消滅陳舊的紅血球的功能。由于近年來人們對藍(lán)點(diǎn)馬鮫的肆意捕撈以及環(huán)境的不斷惡劣，導(dǎo)致藍(lán)點(diǎn)馬鮫的產(chǎn)量急劇減少。本研究通過構(gòu)建藍(lán)點(diǎn)馬鮫的cDNA文庫，尋找一些具有特殊功能的基因，為其深入的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 2014年5月在浙江省寧波市象山港捕撈藍(lán)點(diǎn)馬鮫樣本12尾（平均重750±5g），取其頭腎組織，并快速保存于液氮中，存于-80℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 提取總RNA 取藍(lán)點(diǎn)馬鮫的頭腎組織，至于液氮中研磨，運(yùn)用TRzol法提取總RNA，并取3μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，以確定RNA的質(zhì)量，并運(yùn)用紫外分光光度計(jì)對RNA的純度和濃度進(jìn)行檢測。

1.2.2 cDNA雙鏈的合成 在一個(gè)200μL滅菌離心管中依次加入下列試劑，RNA（1μg），加DEPC水補(bǔ)足到3.25μL；5-Oligo（RT）（20μM）0.5μL；DMSO為0.5μL；然后72℃溫浴3min，冰上冷卻3min，短暫離心后，再依次加入下列試劑：5×First Srand Buffer 2μL，20Mm DTT（Clontech）1μL，dNTPs Mix 1μL，RNase inhibitor（40U＼μL）0.25μL；SMART Scribe RTase（Clontrch）1μL；反應(yīng)條件42℃溫浴1h，70℃15min，冷卻到室溫.然后進(jìn)行第二鏈合成。在第二鏈合成離心管中依次加入First Strand cDNA 2μL，去離子水80μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 10μL，50xdNTPs Mix 2μL，5PCR引物，3PCR引物2μL，及50×Advantage 2 Polymerase Mix 2μL，混勻，反應(yīng)條件：94℃、2min；98℃、10s，60℃、30s，68℃、3min，25個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，取5μL用于瓊脂糖凝膠電泳檢測。其余放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 cDNA與質(zhì)粒載體的連接及轉(zhuǎn)化 產(chǎn)物與pUCm-T載體用T4連接酶連接，反應(yīng)體系如下：PCR產(chǎn)物1μL，pUCm-T載體1μL，2×快連buffer2.5μL，T4 DNA Ligase 0.5μL；反應(yīng)條件：22℃、8min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α中，冰上放置30min，熱擊90s，然后再放回冰上3min，添加 600μLSOC無抗液體培養(yǎng)基，37℃，200振蕩復(fù)蘇培養(yǎng)1h，獲得了藍(lán)點(diǎn)馬鮫頭腎初始cDNA文庫。

1.2.4 cDNA文庫的容量測定 從文庫中取出10μL菌液，用SOC培養(yǎng)基分別稀釋10、100、1 000、10 000倍，然后再分別吸取100μL涂板，37℃豐培養(yǎng)16h。計(jì)算平板的總克隆數(shù)，公式如下：文庫滴度=平板上的克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)/涂板體積）[3]，文庫容量=庫包裝體積×滴度[4]。分別計(jì)算出cDNA文庫滴度和庫容量。

1.2.5 cDNA文庫的質(zhì)量鑒定 cDNA文庫的質(zhì)量鑒定主要有2種方法：一是檢測文庫的重組率，二是對插入片段的檢測。通過應(yīng)用藍(lán)白斑篩選來鑒定文庫的重組率，計(jì)算公式為：重組率（%）=白斑數(shù)/（白斑數(shù)+藍(lán)斑數(shù)）×100[5]。對其插入片段的檢測，隨機(jī)挑取單克隆菌，進(jìn)行菌液檢測PCR，PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃、5min；94℃、1min，55℃、30s，72℃、2min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖電泳的檢測，然后篩選陽性菌送測序。

1.2.6 序列分析 利用NCBI中的VecScreen程序識別所測序列并去除載體，利用DNAStar軟件SeqMan程序比對序列，將得到在GenBank上進(jìn)行BLAST比對分析后的生物EST序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取總RNA和分離mRNA 總RNA的提取純度要高，完整性較好，這是構(gòu)建cDNA文庫的基礎(chǔ)。本研究選用試劑盒從藍(lán)點(diǎn)馬鮫頭腎中獲得RNA，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明（見圖1）：18s和28s的條帶都比較完整和清晰，28s條帶的濃度是18s的2倍，且未發(fā)現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，說明所提取的RNA完整性好，質(zhì)量較高。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測后，RNA濃度為均在295～325ng/μL，而且OD260/OD280均在1.8～2.0，表明RNA的純度較高，并且達(dá)到了反轉(zhuǎn)錄所需的RNA濃度，可以用于cDNA文庫的構(gòu)建。

圖1 藍(lán)點(diǎn)馬鮫總RNA電泳

2.2 cDNA文庫滴度的測定 cDNA文庫主要是通過文庫滴度和文庫容量來檢測的。通過公式計(jì)算之后，原始文庫滴度為2.26×106pfu/mL，文庫容量為1.36×106pfu，而SMART文庫構(gòu)建要求未擴(kuò)增文庫的滴度大于1×106pfu/mL，所以符合建庫的要求。

2.3 cDNA文庫插入片段的測定 從文庫中隨機(jī)挑取24個(gè)單克隆菌，每個(gè)菌落加600μL含Amp抗生素的SOC液體培養(yǎng)基，用載體的通用引物進(jìn)行菌落檢測PCR。檢測結(jié)果（圖2）表明，挑選的這24個(gè)菌中，有23個(gè)出現(xiàn)了清晰條帶，條帶主要集中在1～2kb。根據(jù)公式可計(jì)算出該藍(lán)點(diǎn)馬鮫的頭腎cDNA文庫的重組率為95.8%，而且所構(gòu)建的cDNA文庫中cDNA的插入片段分布均勻，呈現(xiàn)出大小不一的擴(kuò)增片段?？梢姡緦?shí)驗(yàn)成功的構(gòu)建了藍(lán)點(diǎn)馬鮫頭腎的cDNA文庫，為后續(xù)篩選一些有功能的蛋白奠定了良好的基礎(chǔ)。

圖2 菌落檢測PCR電泳

2.4 測序及EST分析 從cDNA原始文庫中挑取50個(gè)單克隆菌進(jìn)行測序，利用NCBI中的VecScreen程序?qū)λ鶞y序列進(jìn)行分析，并去掉載體、短序列及一些相對分子量較低的序列后，共獲得了46個(gè)有效序列，將獲得的EST序列利用NCBI的BlastX進(jìn)行相似性比對分析，選擇一些具有代表性的序列進(jìn)行分析（見表1）。

表1 藍(lán)點(diǎn)馬鮫cDNA文庫部分EST

[克隆編號＼&長度（bp）＼&相似度（%）＼&相似基因來源的物種名＼&推定蛋白種類＼&推定蛋白功能＼&S3＼&981＼&90＼&奈里樸麗魚＼&泛素連接酶＼&是蛋白質(zhì)降解的信號＼&S4＼&983＼&86＼&深裂眶鋸雀鯛＼&甲基轉(zhuǎn)移酶＼&能引起氨基酸轉(zhuǎn)移＼&S8＼&1073＼&90＼&斑馬宮麗魚＼&真核翻譯起始因子＼&參與真核生物的翻譯＼&S11＼&992＼&89＼&斑馬宮麗魚＼&鈣網(wǎng)蛋白＼&調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子＼&S13＼&1028＼&86＼&大黃魚＼&CSRP2蛋白＼&促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂＼&S16＼&936＼&83＼&尼羅非魚＼&鋅指蛋白＼&調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄＼&S27＼&1060＼&90＼&大黃魚＼&肽鏈釋放因子＼&調(diào)控細(xì)胞周期，組建細(xì)胞骨架＼&S29＼&980＼&96＼&安大略鮭＼&促分裂素活化蛋白＼&促進(jìn)細(xì)胞分裂＼&S36＼&1028＼&91＼&尼羅非魚＼&SH3結(jié)構(gòu)域蛋白＼&介導(dǎo)信號分子與富含脯氨酸的蛋白分子結(jié)合＼&S37＼&982＼&90＼&紅旗東方鲀魚＼&絲/蘇氨酸蛋白激酶＼&刺激胞外基質(zhì)合成＼&S39＼&1013＼&88＼&慈鯛類＼&輸入蛋白＼&幫助核蛋白進(jìn)入細(xì)胞核＼&S48＼&956＼&89＼&布氏新亮麗鯛＼&KLF轉(zhuǎn)錄因子＼&參與細(xì)胞增殖、凋亡和分化＼&S54＼&923＼&87＼&大黃魚＼&PDZ結(jié)構(gòu)域＼&調(diào)控蛋白質(zhì)之間相互作用＼&S74＼&952＼&90＼&尼羅非魚＼&BTG1蛋白＼&參與細(xì)胞代謝＼&]

3 討論與結(jié)論

cDNA文庫的構(gòu)建是一種基礎(chǔ)工具，可以研究基因的功能和發(fā)現(xiàn)新基因，因而被廣泛運(yùn)用于生物學(xué)研究領(lǐng)域中。目前通過cDNA文庫篩選已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多基因[6]，而以藍(lán)點(diǎn)馬鮫為原材料構(gòu)建cDNA文庫尚未報(bào)道。本研究通過提取RNA，采用In-Fusion SMARTerTM Directional cDNA Library Construction Kit技術(shù)，構(gòu)建藍(lán)點(diǎn)馬鮫頭腎cDNA文庫，并通過對其容量、質(zhì)量的檢測，從而判斷該文庫的參考價(jià)值的。

本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的原始cDNA文庫的滴度為

2.26×106pfu/mL，而構(gòu)建文庫一般要求其滴度≥1×106pfu/mL，與目前已經(jīng)構(gòu)建的cDNA文庫比較，例如張少會(huì)等[7]構(gòu)建的草莓果實(shí)cDNA文庫原始滴度為1.13×106pfu/mL；韋春梅等[8]構(gòu)建松墨天牛幼蟲的cDNA文庫原始滴度為5.45×106pfu/mL；陳美元[9]構(gòu)建了雙孢蘑菇As2796全長cDNA文庫的原始滴度為3.3×106pfu/mL，經(jīng)過查閱文獻(xiàn)及比較，表明本研究所構(gòu)建的文庫是可以滿足之后實(shí)驗(yàn)的需要。此外，對其插入片段進(jìn)行檢測，其片段長度平均為1 000bp。

高質(zhì)量的RNA是活的cDNA的基礎(chǔ)，RNA的純度和完整性決定著cDNA文庫信息的完整性[10-11]。本實(shí)驗(yàn)為了提高RNA的質(zhì)量，不經(jīng)過mRNA的純化過程，直接用總RNA來建庫，減少了mRNA的降解和丟失，可以使mRNA最大限度的轉(zhuǎn)錄為cDNA。此外，在LD-PCR中，設(shè)置25個(gè)循環(huán)，合成了足量的cDNA，使文庫的表達(dá)序列變得富集。

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