葉揚(yáng)旻

【摘 要】目的：建立芐星青霉噻唑酸有關(guān)物質(zhì)測定的梯度洗脫HPLC法。方法：采用端基封尾的C18柱，流動(dòng)相A為0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.1），流動(dòng)相B為甲醇，流速1.0mL·min-1，線性梯度洗脫，檢測波長220nm，柱溫40℃。結(jié)果：芐星青霉噻唑酸分別與相鄰雜質(zhì)峰分離完全，檢測限為3ng，定量限為11ng。結(jié)論：本法專屬、靈敏，精密度和耐用性良好，可作為芐星青霉噻唑酸有關(guān)物質(zhì)和色譜純度的測定方法。

【關(guān)鍵詞】芐星青霉噻唑酸；有關(guān)物質(zhì)

芐星青霉噻唑酸（benzylpenicilloic acids benzathide）為芐星青霉素（Benzathine Benzylpenicillin）中的主要雜質(zhì)，又稱雜質(zhì)C，其結(jié)構(gòu)式收載于歐洲藥典和英國藥典芐星青霉素的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。中國藥典[1]和國外藥典。芐星青霉素有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下均采用不加校正因子的主成分對(duì)照法定量。本文參考中國藥典芐星青霉素有關(guān)物質(zhì)的檢查方法[3]和有關(guān)文獻(xiàn)[2，3]，經(jīng)方法學(xué)研究和驗(yàn)證，建立了面積歸一化法測定芐星青霉噻唑酸的有關(guān)物質(zhì)和色譜純度，方法專屬、靈敏，精密度和耐用性良好。

1 材料與方法

1.1 儀器及試藥

Waters 2695高效液相色譜儀、Agilent 1100高效液相色譜儀、Agilent 1260高效液相色譜儀、島津LC-20AT高效液相色譜儀。色譜柱：Phenomenex Luna C18（2）（4.6×250mm，5μm）、依利特SinoChrom ODS-AP （4.6×250mm，5μm）、Agela Venusil XBP C18（2） （4.0×250mm，5μm）、Discovery SUPELCO（4.6×250mm，5μm）。

芐星青霉噻唑酸為自行研制。磷酸二氫鉀為分析純，甲醇為色譜純。

1.2 色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（端基封尾）；流動(dòng)相A為0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.1），流動(dòng)相B為甲醇，流速為每分鐘1.0ml，線性梯

度洗脫；柱溫為40℃；檢測波長為220nm。

1.3 測定法

精密稱取本品約10mg，置10ml量瓶中，加乙腈2ml和甲醇2ml超聲使溶解，用磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀6.8g與磷酸氫二鉀1.14g，加水溶解并稀釋成1000ml）稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。分別取供試品溶液及空白溶液各20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.4 系統(tǒng)適用性

供試品溶液色譜圖中，理論板數(shù)按芐星青霉噻唑酸峰計(jì)算為25010，與相對(duì)主峰保留時(shí)間1.06倍處的雜質(zhì)峰間的分離度為2.3，符合藥典要求。

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察

熱破壞試驗(yàn)：取樣品5mg，置5ml量瓶中，加乙腈1ml和甲醇1ml超聲使溶解，用上述磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，置100°C水浴中加熱30min，放冷，進(jìn)樣。

酸破壞試驗(yàn)：取樣品5mg，置5ml量瓶中，加乙腈1ml和甲醇1ml超聲使溶解，加1mol/L鹽酸溶液1.0ml，放置10min，加1mol/L氫氧化鈉溶液1.0ml中和，用上述磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣。

堿破壞試驗(yàn)：取樣品5mg，置5ml量瓶中，加乙腈1ml和甲醇1ml超聲使溶解，加1mol/L氫氧化鈉溶液1.0ml，放置10min，加1mol/L鹽酸溶液1.0ml中和，用上述磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣。

降解產(chǎn)物峰與主峰，降解產(chǎn)物峰之間均分離良好。

2.2 檢測限和定量限

精密稱取本品10mg，置10ml量瓶中，加乙腈2ml和甲醇2ml超聲使溶解，用上述磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻。精密量取適量，分別用上述磷酸鹽緩沖液稀釋制成系列濃度的溶液，注入液相色譜儀。以信噪比S/N 為3時(shí)，注入儀器的量確定檢測限為3ng。以信噪比S/N為10時(shí)，注入儀器的量確定定量限為11ng。

3 精密度試驗(yàn)

3.1 重復(fù)性

取本品，依法測定6次，按面積歸一化法計(jì)算芐星青霉噻唑酸的色譜純度，平均值為99.52%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.04%（n=6）。按面積歸一化法計(jì)算雜質(zhì)總和，平均值為0.48%（n=6）。

3.2 中間精密度

不同實(shí)驗(yàn)人員，在不同實(shí)驗(yàn)日期，采用不同廠牌的高效液相色譜儀和色譜柱，同法測定6次，色譜純度平均值為99.67%（n=6），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.02%。雜質(zhì)總和平均值為：0.33%（n=6）。

4 耐用性考察

分別采用Waters 2695、Agilent 1100、Agilent 1260、島津LC-20AT 四種型號(hào)高效液相色譜儀，依利特SinoChrom、Agela Venusil XBP 、Phenomenex Luna 、Discovery SUPELCO四種廠牌色譜柱，流動(dòng)相的甲醇比例在±5%，緩沖鹽溶液的pH值在3.1±0.1，流速在1.0±0.2 mL·min-1，柱溫在40±5°C范圍內(nèi)變動(dòng)，對(duì)破壞樣品、樣品進(jìn)行測試，結(jié)果主峰分別與相鄰雜質(zhì)峰均有良好的分離。

5 討論

色譜柱的選擇： 由于二芐基乙二胺及其有關(guān)物質(zhì)可能在制備或降解過程中引入或產(chǎn)生，作為芐星青霉噻唑酸中的雜質(zhì)，其分子中的堿性基團(tuán)易與色譜柱的殘留硅醇基形成氫鍵，造成色譜峰嚴(yán)重拖尾甚至吸附，故應(yīng)選用端基封尾完全的C18柱，有利于雜質(zhì)檢出。

參考文獻(xiàn)

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：307-308.

[2]蘇倩，雷勇勝，劉小琳等.藥物中雜質(zhì)對(duì)照品的標(biāo)定項(xiàng)目與純度測定方法研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2012，27（2）：150-154.