馬雙姣，楊培，周紅，孫偉，姚輝*，李永華

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530001)

·專題·

鴉膽子藥材及其混偽品的 ITS2 序列分子鑒定研究△

馬雙姣1，楊培1，周紅1，孫偉2，姚輝1*，李永華3*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530001)

目的：通過(guò)分析鴉膽子及其混偽品的ITS2序列，探究鑒定鴉膽子藥材及其混偽品的新方法。方法：采用改良的CTAB法提取鴉膽子及其混偽品的基因組DNA，PCR擴(kuò)增ITS2片段。對(duì)其進(jìn)行雙向測(cè)序，應(yīng)用MEGA 6.0軟件進(jìn)行序列分析，計(jì)算種內(nèi)、種間遺傳距離，構(gòu)建鄰接樹。結(jié)果：鴉膽子藥材ITS2序列長(zhǎng)度為230 bp，種內(nèi)最大K2P遺傳距離為0.018，小于其與混偽品的種間平均K2P遺傳距離0.493。NJ樹結(jié)果表明鴉膽子序列和柔毛鴉膽子序列聚為一支，與其他混偽品可明顯區(qū)分。鴉膽子與柔毛鴉膽子在35位點(diǎn)處有一變異位點(diǎn)，利用此位點(diǎn)能將鴉膽子與柔毛鴉膽子區(qū)別開來(lái)。結(jié)論：ITS2可作為鴉膽子藥材及其混偽品鑒定的DNA條形碼序列，為保障臨床用藥安全提供了新的技術(shù)手段。

鴉膽子；ITS2；鑒定；DNA條形碼；混偽品

中藥材鴉膽子(Bruceae Fructus)為苦木科植物鴉膽子Bruceajavanica(L.)Merr.的干燥成熟果實(shí)，產(chǎn)于我國(guó)南方地區(qū)。鴉膽子性味苦，寒，有小毒，具有清熱解毒，截瘧，止痢的功效。可用于痢疾，瘧疾，外治贅疣，雞眼[1]。鴉膽子含生物堿、糖苷、酚性成分和鴉膽子酸，具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡及影響相關(guān)基因表達(dá)、提高機(jī)體免疫功能、抗瘧、抗腫瘤、抗阿米巴、驅(qū)腸蟲等多種生物活性，研究表明鴉膽子油靜脈乳油滴和癌細(xì)胞親和力較大，有直接殺傷作用，并能保護(hù)正常骨髓，提高白細(xì)胞的數(shù)量，其作用完全符合其腐蝕贅擾的功效，具有重要的藥用價(jià)值[2-6]。然而工作中常有偽品苦木科柔毛鴉膽子BruceamollisWall.、交讓木科植物牛耳楓DaphniphyllumcalycinumBenth.、木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.、黃楊科植物小葉黃楊BuxusmicrophyllaSieb.et Zucc.、楝科植物灰毛漿果楝Cipadessacinerascens(Pell.)H.-M.的干燥果實(shí)以及豆科植物苦參SophoraflavescensAit.的種子相混之[7-10]。由于它們功效相差甚遠(yuǎn)，混用亂用不僅耽誤病情，還嚴(yán)重影響了臨床用藥安全，因此對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定顯得尤為重要。

近年來(lái)，已有多位學(xué)者對(duì)鴉膽子及其混偽品從藥材性狀、顯微特征等方面進(jìn)行鑒別[7-10]。而從DNA條形碼的角度對(duì)鴉膽子及其混偽品的鑒定研究甚少，僅李美妮等[11]在對(duì)女貞子及其混偽品的研究中將鴉膽子作為女貞子的混偽品之一進(jìn)行了ITS2序列分析。

DNA條形碼是Hebert等[12]于2003年首次提出的，是利用基因組中一段公認(rèn)的、相對(duì)較短的DNA序列來(lái)進(jìn)行物種鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)，是傳統(tǒng)形態(tài)鑒別方法的有效補(bǔ)充，成為近年來(lái)生物分類和物種鑒定的研究熱點(diǎn)[13-16]。Chen等[17]通過(guò)對(duì)6000余份藥用植物樣本進(jìn)行DNA條形碼序列篩選，發(fā)現(xiàn)ITS2序列的物種水平鑒定能力達(dá)92.7%，并首次提出以ITS2為核心，psbA-trnH為補(bǔ)充序列的藥用植物DNA條形碼鑒定體系。隨后Yao等[18]提出了ITS2序列可作為植物物種鑒定通用條形碼。ITS2序列作為DNA條形碼的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性在紅景天[19]、重樓屬[20]、川芎[21]、蛇床[22]、羌活[23]、北豆根[24]、金銀花[25]等中藥材鑒定中得到驗(yàn)證。目前，中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則已納入《中華人民共和國(guó)藥典》2010版第三增補(bǔ)本[1]。

為確保鴉膽子藥材的正確用藥和安全用藥，本研究應(yīng)用DNA條形碼序列ITS2對(duì)鴉膽子藥材及其易混品進(jìn)行鑒定研究，為鴉膽子的準(zhǔn)確鑒定提供依據(jù)。

1 植物材料

本研究涉及鴉膽子及其混偽品共9個(gè)物種41個(gè)研究對(duì)象，包含實(shí)驗(yàn)樣本33份，GenBank下載序列8條。其中鴉膽子樣本22份(包括基原植物樣本、藥材樣本、復(fù)核樣本和對(duì)照藥材樣本)，相關(guān)信息詳見(jiàn)表1。樣品均經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定。復(fù)核樣本由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所進(jìn)行復(fù)核，對(duì)照藥材(編號(hào)FDC321)來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

表1 材料來(lái)源

2 方法

2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

將鴉膽子及其混偽品用75%酒精棉擦拭干凈后，切碎，果實(shí)樣品取果皮約30 mg，葉片樣品取變色硅膠干燥葉片約20 mg，用研磨儀(Retsch MM400，Germany)研磨2 min(30次/秒)后用植物DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取總DNA，56 ℃水浴過(guò)夜(葉片樣本65 ℃水浴1 h)，其余步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。ITS2通用引物S2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′和S3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。反應(yīng)條件為94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40 循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)體系為2×Taq Mix Master 12.5 μL、正反向引物(2.5 μM)各1.0 μL、總DNA 2 μL(～30 ng)，其余用ddH2O補(bǔ)至25 μL。電泳查看PCR擴(kuò)增情況，進(jìn)行雙向測(cè)序。

2.2 數(shù)據(jù)處理

將所有的序列用軟件MEGA 6.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)分析[26]，并基于K2P模型進(jìn)行遺傳距離等分析，用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，利用Bootstrap(1000 次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的支持率。

3 結(jié)果與分析

3.1 鴉膽子及其混偽品ITS2序列特征

本研究比較了22條鴉膽子ITS2序列，所得序列比對(duì)后長(zhǎng)度為230 bp，變異位點(diǎn)為4個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)3個(gè)(簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)是指在兩個(gè)及以上分類單元的序列中存在差異，且其中至少有兩種變異類型在該位點(diǎn)出現(xiàn)兩次及以上)，有4個(gè)單倍型，各單倍型變異位點(diǎn)及序列條數(shù)見(jiàn)表2。鴉膽子與各混偽品種間序列進(jìn)行比對(duì)后長(zhǎng)度為266 bp，鴉膽子平均GC含量64.2%，混偽品中GC含量最高的是小葉黃楊，為71.7%，GC含量最低的是女貞，為53.8%。應(yīng)用MEGA 6.0進(jìn)行分析，以Kimura 2-parameter(K2P)計(jì)算遺傳距離。鴉膽子的種內(nèi)K2P距離為0～0.018，平均K2P距離為0.005。與其混偽品柔毛鴉膽子、牛耳楓、女貞、小葉黃楊、苦參以及灰毛漿果楝平均K2P距離分別為0.014、0.769、0.594、0.657、0.646以及0.280，除柔毛鴉膽子外，鴉膽子與其它混偽品的種間最小K2P距離大于種內(nèi)最大K2P距離(見(jiàn)表3)。ITS2序列間存在的變異位點(diǎn)多達(dá)192個(gè)。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，鴉膽子22份樣品的ITS2序列在35位點(diǎn)處均為C，柔毛鴉膽子為T，可通過(guò)此位點(diǎn)對(duì)鴉膽子和柔毛鴉膽子進(jìn)行區(qū)分，但尚需收集柔毛鴉膽子樣品對(duì)此變異位點(diǎn)的穩(wěn)定性進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2 鴉膽子及其混偽品的聚類分析

通過(guò)基于ITS2序列(單倍型)構(gòu)建的鴉膽子及其混偽品的NJ系統(tǒng)聚類樹可以看出(如圖1)，鴉膽子序列與柔毛鴉膽子序列聚為一支，混偽品牛耳楓、女貞、小葉黃楊、苦參以及灰毛漿果楝各自聚為一支，能夠與鴉膽子明顯區(qū)分開。因此，ITS2序列作為條形碼可準(zhǔn)確鑒別鴉膽子藥材及其混偽品牛耳楓、女貞、小葉黃楊、苦參以及灰毛漿果楝。

表2 鴉膽子ITS2序列變異位點(diǎn)

注：*表示與第一行堿基相同。

表3 種內(nèi)種間K2P距離計(jì)算結(jié)果

圖1 基于ITS2序列構(gòu)建的鴉膽子與其混偽品的NJ樹(拉丁名后為單倍型編號(hào)Bootstrap 1000次重復(fù)，支上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%)

4 討論

我國(guó)中藥資源種類繁多，蘊(yùn)藏量大，但人均分布少，且近年來(lái)隨著人們生活水平和保健意識(shí)的提高，中藥的需求量也越來(lái)越大，致使市場(chǎng)上以假亂真的現(xiàn)象頻繁出現(xiàn)，中藥基原鑒定的準(zhǔn)確性對(duì)資源的可持續(xù)利用以及中藥的臨床療效至關(guān)重要。傳統(tǒng)的中藥材鑒定方法，如性狀、顯微、和化學(xué)定性分析法、色譜法等，在中藥材鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)中雖然發(fā)揮了重要作用，但是這些傳統(tǒng)的鑒定方法各有優(yōu)劣：藥材形態(tài)鑒定難以區(qū)分性狀相似的近緣種，而且植物形態(tài)易受地理環(huán)境、生長(zhǎng)期、貯存條件諸多因素的影響，從而影響鑒定的準(zhǔn)確性；化學(xué)分析方法會(huì)因中藥活性成分的含量受到其生理?xiàng)l件、采收時(shí)間、貯藏等因素的影響，同時(shí)對(duì)化學(xué)成分相似的物種也較難以區(qū)分。生藥鑒定學(xué)的發(fā)展面臨巨大的挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)生藥鑒定方法難以滿足現(xiàn)代物種鑒定的需求[27]。DNA條形碼鑒定技術(shù)只需選用一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因片段即可對(duì)某個(gè)屬、科甚至幾十個(gè)科的絕大部分物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，且鑒定過(guò)程更加快速，重復(fù)性和穩(wěn)定性高，不受藥材性狀的影響，直接從基因水平提供鑒定依據(jù)，即使是沒(méi)有任何鑒別經(jīng)驗(yàn)的人員通過(guò)DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)化流程都能夠準(zhǔn)確區(qū)分藥材的正品及混偽品。DNA條形碼的研究將日臻完善，為植物的分類鑒定及新物種的發(fā)現(xiàn)提供快捷、準(zhǔn)確的信息，成為植物分類學(xué)家有益的輔助工具，并能有效鑒定中藥材基原植物。

本文測(cè)定了鴉膽子及其混偽品的ITS2條形碼序列，結(jié)果表明除柔毛鴉膽子外，鴉膽子與其混偽品的ITS2序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)較多，鴉膽子種內(nèi)最大遺傳距離(0.018)小于其與除柔毛鴉膽子以外的混偽品種間最小遺傳距離(0.269)。基于ITS2序列建立的NJ樹可以很明顯地把不同來(lái)源的鴉膽子與其混偽品牛耳楓、女貞、小葉黃楊、苦參以及灰毛漿果楝鑒別開來(lái)；鴉膽子與柔毛鴉膽子在35位點(diǎn)處有一變異位點(diǎn)，但由于柔毛鴉膽子樣本量偏少，還需要收集柔毛鴉膽子樣品對(duì)此位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究中鴉膽子與其混偽品女貞子ITS2序列的K2P距離及NJ樹聚類結(jié)果均與李美妮等基于ITS2序列的女貞子原植物及其混偽品的分子鑒定[11]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明采用DNA條形碼技術(shù)鑒定藥材具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。由此可見(jiàn)，采用DNA條形碼技術(shù)能夠更加快速、準(zhǔn)確的完成中藥材鑒定工作，在今后的藥材流通和市場(chǎng)管理等實(shí)際應(yīng)用中具有極大的價(jià)值。

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MolecularIdentificationofBruceajavanicaandItsAdulterantsBasedonITS2Sequence

MAShuangjiao1，YANGPei1，ZHOUHong1，SUNWei2，YAOHui1*，LIYonghua3*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China；2.InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalScience，Beijing100700，China；3.CollegeofPharmacy，GuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanning530001，China)

Objective：To explore a new method to identifyBruceajavanica(L.)Merr.from its adulterants by the ITS2 regions.Methods：Genomic DNA ofB.javanicaand its adulterants were extracted by modified CTAB method and then the ITS2 sequences were obtained by PCR amplification and sequenced bidirectionally.All of the 41 ITS2 sequences were aligned through Clustal-W and the genetic distances were computed using MEGA 6.0 in accordance with the Kimura 2-parameter(K2P)model.Results：The sequence lengths of ITS2 regions ofB.javanicawere 230bp.The intra-specific genetic distances were smaller than the average inter-specific ones in ITS2 regions ofB.javanicaand its adulterants.The NJ tree showed thatB.javanicaand its adulterants could be easily differentiated according to their monophyly exceptB.mollis.The ITS2 sequences ofB.javanicaandB.mollishad a variation point at thirty-fifth site，soB.javanicaandB.molliswere able to be identified by this site.Conclusion：ITS2 can be used to identifyB.javanicaand its adulterants，which provide a new technique to ensure its clinical safety.

Bruceajavanica；ITS2；Identify；DNA barcoding；Adulterants

2015-04-08)

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2011BAI07B08)；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013GXNSFAA019120)

*

姚輝，副研究員，研究方向：中藥資源，Tel：(010)57833194，E-mail：scauyaoh@sina.com； 李永華，教授，研究方向：中藥資源，E-mail：liyonghua185@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.003