楊月英，黃嬌芳，顧金杰，史吉平，王紅英,*

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034；2.中國科學(xué)院上海高等研究院，生物煉制實驗室，上海201210；3.上?？萍即髮W(xué)物質(zhì)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，生物靈感工程實驗室，上海201210）

L-肉堿的生理功能、生物學(xué)制備及檢測方法研究進(jìn)展

楊月英1，黃嬌芳2,3，顧金杰2，史吉平2，王紅英1,*

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034；2.中國科學(xué)院上海高等研究院，生物煉制實驗室，上海201210；3.上?？萍即髮W(xué)物質(zhì)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，生物靈感工程實驗室，上海201210）

L-肉堿即左旋肉堿，又叫維生素BT，是一種廣泛存在于動物、植物以及部分微生物體內(nèi)的活性異構(gòu)體，其主要功能是參與脂肪酸的代謝。近年來，L-肉堿越來越廣泛地用于新型的功能食品和降血脂新藥的開發(fā)，因此，其生產(chǎn)方法和檢測都面臨更高的技術(shù)要求。文章重點綜述了L-肉堿的生理功能、生物法制備以及檢測方法，并對其未來發(fā)展方向進(jìn)行展望。

L-肉堿；脂肪酸代謝；生物合成法；活性異構(gòu)體；檢測

L-肉堿即左旋肉堿，化學(xué)名為β-羥基-γ-三甲銨丁酸，分子式為C7H15NO3，相對分子質(zhì)量為161.20，分子結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1　1L-肉堿的分子結(jié)構(gòu)Fig.1Molecular structure of L-carnitine

L-肉堿是無色結(jié)晶，易吸潮，是肉堿左（L型）、右（D型）旋異構(gòu)體之一，動物體內(nèi)只有左旋肉堿具有生理活性，它與動物體內(nèi)脂肪酸代謝相關(guān)，主要功能是作為載體將長鏈脂肪酸從線粒體膜外運送到膜內(nèi)以促進(jìn)脂肪酸的β氧化，促進(jìn)脂肪代謝轉(zhuǎn)變?yōu)槟芰縖1-2]。

D-肉堿是L-肉堿的競爭性抑制劑，美國食品藥品監(jiān)督管理局于1993年禁止銷售D型和DL型（混旋型）肉堿，在制藥和保健品配方方面，2006年歐洲藥典和2008年美國藥典分別對其旋光性進(jìn)行測定，規(guī)定了其用量不得超過4%[3]。因此對通過化學(xué)拆分DL-肉堿生產(chǎn)L-肉堿的方法提出了更高的要求[4]。

目前，國內(nèi)L-肉堿的用途極為廣泛，包括添加到多種食品及保健品中：如嬰兒奶粉中、運動員飲料中、減肥健美食品中；添加到豬、雞飼料和魚餌料等飼料中；醫(yī)療用藥物中可作為治療肉堿缺乏癥、高血脂、肥胖癥等疾病[1,5-6]。

1　1L-肉堿的生理功能

1.1L-肉堿的抗疲勞功能

糖在無氧條件下產(chǎn)生的乳酸在血液中的積累和蛋白質(zhì)代謝（主要是氧化脫氨基作用）產(chǎn)生的副產(chǎn)物氨類物質(zhì)的積累是致疲勞的主要原因，左旋肉堿具有抗疲勞作用，周筱燕等[7]研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠胃內(nèi)注射左旋肉堿后，小鼠負(fù)重游泳時間明顯長于對照組，其作用機理是左旋肉堿可以增加肌肝糖原儲備，減少運動后肌肝糖原的消耗，抑制乳酸生成，并將脂肪β氧化后產(chǎn)生的脂酰輔酶A排出體外，避免與有機酸結(jié)合而導(dǎo)致代謝性酸中毒。此外，L-肉堿還與氨類物質(zhì)結(jié)合后以尿液形式排出體外，防止氨中毒。因此，L-肉堿能延緩運動性疲勞的產(chǎn)生，也可使運動員快速從疲勞中恢復(fù)[8-9]。

1.2神經(jīng)保護(hù)作用

L-肉堿不僅在脂肪氧化過程中起重要作用，而且還是一種保護(hù)組織免受氧化損傷的有效抗氧化劑（自由基清除劑），圖2顯示了L-肉堿在人體細(xì)胞內(nèi)的生物合成、分布及主要的生理功能[9]。此外，L-肉堿也具有通過血腦障壁的能力，雖然目前對于L-肉堿在大腦中的調(diào)控方式并未完全明了，但確定的是乙酰肉堿在神經(jīng)元中是乙酰膽堿合成的乙?；d體，并且影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和相關(guān)基因的表達(dá)。Virmani等[10]從患有遺傳性神經(jīng)代謝疾病的病癥中觀察到在這些紊亂的調(diào)節(jié)中L-肉堿參與了不完全的氧化還原反應(yīng)。因此，補充L-肉堿不僅能防止組織中L-肉堿的缺乏，也能預(yù)防神經(jīng)方面的疾病。國內(nèi)外許多研究已發(fā)現(xiàn)乙酰肉堿可以減緩神經(jīng)元的衰退和加快再生[11-13]。

圖22L-肉堿在人體正常生理條件下在細(xì)胞內(nèi)的生物合成、分布以及主要生理功能Fig.2L-Carnitine biosynthesis，distribution and main functions in cells under physiological conditions

1.3抗氧化性能

最近國內(nèi)外研究報道，L-肉堿具有清除過氧化氫、超氧游離子和螯合過渡金屬離子的能力[9,14]，且對于內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)也起保護(hù)的作用，包括谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性免受過氧化傷害，且能避免因隨著年齡的增長而發(fā)生的過氧化損傷[15]。研究表明，乙酰-L-肉堿能提高老齡動物的學(xué)習(xí)能力，改善老年癡呆癥癥狀，減輕腦缺血后的神經(jīng)損傷和再灌注[16]，且能提高嚴(yán)重肝性腦病患者的認(rèn)知能力[13]，對腎臟病、心血管病和糖尿病等疾病也能起到預(yù)防作用[17-18]。Calò[6]、Calvin[19]等報道，在一些病例中丙酰-L-肉堿能保護(hù)人體內(nèi)皮細(xì)胞不被氧化，其主要途徑是通過降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和黃嘌呤氧化酶活性，并且刺激亞鐵血紅素氧合酶-1和內(nèi)皮一氧化氮合成酶等氧化標(biāo)記的基因表達(dá)。

1.4治療遺傳病中的L-肉堿缺乏癥

有機酸血癥是由于氨基酸、碳水化合物、脂質(zhì)及其在線粒體內(nèi)積累的有機酸和?；x物而引起分解代謝中的特定酶失活的一種先天性代謝異常病[20]。其臨床病癥是由于?；o酶A化合物的積累而阻斷了上述3 種物質(zhì)的分解代謝途徑，酰基輔酶A化合物水解為游離酸而導(dǎo)致的嚴(yán)重酸中毒，這些積累的有機酸不但會導(dǎo)致游離肉堿的活性下降，并且致使其結(jié)合一些化合物以尿的形式排出體外[21]。大量實驗表明，有機酸血癥中積累的代謝產(chǎn)物可能會干擾體內(nèi)能量和氧化還原反應(yīng)的平衡[22]。在有機酸敗血癥和脂肪酸氧化缺陷癥中，也發(fā)現(xiàn)了中鏈?；o酶A脫氫酶（medium-chain acyl-coenzyme A dehydrogenase，MCAD）、長鏈酰基輔酶A脫氫酶（long-chain acyl-CoA dehydrogenase，LCAD）、超長鏈?；o酶A脫氫酶（very-long-chain acyl-CoA dehydrogenase，VLCAD）和長鏈3-羥基-CoA脫氫酶（long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，LCHAD）的缺乏，有研究人員提出在肝臟中積累的這些有機酸有毒化合物將會導(dǎo)致肝功能病變，此外，它們也會被釋放到其他組織如大腦中。因此，有機酸血癥和脂肪酸氧化缺陷癥的實質(zhì)原因是L-肉堿的缺乏[22-23]。

1.5治療遺傳性的神經(jīng)代謝疾病

L-肉堿不僅被應(yīng)用于許多遺傳性的神經(jīng)代謝障礙的治療，其還具有抑制過量的乙酰CoA積累的作用，在醫(yī)療中通常用口服和注射的方式應(yīng)用于治療。大量研究表明，在一些有機酸敗血癥中的生化檢測和臨床診斷可以用L-肉堿治療法，其原理是通過中心代謝中L-肉堿的標(biāo)準(zhǔn)組分化療來進(jìn)一步確定病癥。因此，患者應(yīng)補充L-肉堿，以促進(jìn)排除乙酰類等有毒物質(zhì)并補充細(xì)胞內(nèi)外缺少的游離肉堿，同時能及時釋放出對其他氧化途經(jīng)有用的乙酰CoA。根據(jù)病人的年齡、營養(yǎng)狀況及代謝情況，每天攝取的L-肉堿的劑量范圍在50～300 mg/kg之間[24-25]。也有研究發(fā)現(xiàn)，L-肉堿對丙酸血癥、甲基丙二酮癥、異戊酸血癥、3-羥基-3-甲基戊二酸血癥和戊二酸尿癥Ⅰ型等患者也有利[26]。

2　2L-肉堿的制備方法

2.1L-肉堿的生物制備方法與合成途徑

L-肉堿的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、直接提取法、微生物發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法等。目前，國內(nèi)主要采用化學(xué)合成法生產(chǎn)，即先合成DL-混旋肉堿，然后進(jìn)行拆分得到L-肉堿，該方法環(huán)境污染較大，并且廢棄副產(chǎn)物D-肉堿而造成資源浪費[5]。生物轉(zhuǎn)化法能比化學(xué)合成法減少排放50%的有機廢物、減排25%的廢水和減排90%的焚燒廢物[27]，因此生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-肉堿成為研究的熱點，目前主要研究是用巴豆甜菜堿為底物合成L-肉堿。大部分微生物都有將一些前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為L-肉堿的能力，如細(xì)菌、放線菌、霉菌、酵母菌中幾十個屬的上百種微生物，產(chǎn)量比較顯著的微生物有：大腸桿菌（Escherichia）、變形桿菌（Proteus）、醋酸桿菌（Acetobacter）、不動桿菌（Acinetobacter）、假單胞菌（Pseudomonas）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）、泡盛曲霉（Aspergillus awamor）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、紅曲霉（Monascus anka）、黑曲霉（Aspergillus niger）等[28]。表1列出了能將一些底物轉(zhuǎn)化為L-肉堿的微生物及其相關(guān)的酶[27]，圖3顯示了微生物體內(nèi)L-肉堿的合成代謝途徑。

表1　轉(zhuǎn)化手性或非手性底物為L-肉堿的微生物及其轉(zhuǎn)化過程中相關(guān)的酶Table1Microorganisms used fordfor L L-carnitine production from chiral iral and achiral substrates and the enzyme activities involved

不同底物采用的代謝途徑及涉及的酶不同，主要采用的底物有巴豆甜菜堿、γ-丁基甜菜堿和D-肉堿，涉及的酶包括：1）以γ-丁基甜菜堿為底物的代謝酶有γ-丁基甜菜堿羥化酶、γ-丁基甜菜堿CoA連接酶、γ-丁基甜菜堿CoA脫氫酶和L-肉堿脫水酶等[29]；2）以巴豆甜菜堿為底物涉及的代謝酶有巴豆甜菜堿CoA連接酶、巴豆甜菜堿CoA水和酶和巴豆甜菜堿CoA還原酶等[27,30]；3）以D-肉堿為底物的代謝途徑涉及的酶主要是D-肉堿消旋酶[31]。 2.2 利用巴豆甜菜堿為底物轉(zhuǎn)化生成L-肉堿

圖3微生物體內(nèi)L-肉堿的合成代謝途徑Fig.3L-carnitine metabolism in bacteria

圖4微生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化巴豆甜菜堿生成L-肉堿的途徑Fig.4Biotransformation pathway from crotonobetaine to L-carnitine in bacteria

此過程中巴豆甜菜堿在水溶性胞內(nèi)酶巴豆甜菜堿水合酶（CaiD）的作用下生成L-肉堿，由于是胞內(nèi)酶，所以此過程需要巴豆甜菜堿轉(zhuǎn)移酶（CaiT）的協(xié)助，也有研究報道細(xì)胞經(jīng)破碎后其轉(zhuǎn)化率大大提高，但此方法對產(chǎn)物后處理并不利。巴豆甜菜堿還原酶（CaiA）只在有氧或厭氧條件下電子受體量多于巴豆甜菜堿時存在，催化巴豆甜菜堿轉(zhuǎn)化成γ-丁基甜菜堿，因此在基因改造過程中通常將編碼巴豆甜菜堿CoA還原酶（CaiA）的基因（caiA）刪除來提高L-肉堿的產(chǎn)量，目前研究較清楚的有大腸桿菌E. coli O44 K74，其肉堿的代謝與位于染色體上的操縱子caiTABCDE有關(guān)[32-33]。1995年，Eiehler等[34-35]將大腸桿菌中caiD（編碼巴豆甜菜堿水和酶CaiD的基因）、caiE基因克隆并獲得轉(zhuǎn)基因工程菌E. coli K38，其肉堿消旋酶含量大增，活性顯著提高，更有利于轉(zhuǎn)化DL-肉堿為L-肉堿。

最近也有研究人員將E. coli BW25113菌株進(jìn)行了基因改造，當(dāng)微生物以巴豆甜菜堿為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化時，主要有兩個去路，一個是在巴豆甜菜堿CoA水和酶CaiD（由caiD基因編碼）的作用下生成L-肉堿，而另一個去路是在巴豆甜菜堿CoA還原酶CaiA（由caiA基因編碼）的作用下生成了γ-丁基甜菜堿，這一途徑對產(chǎn)L-肉堿很不利，因此若阻斷這一途徑，必須敲除caiA基因[27,30]。目前也發(fā)現(xiàn)延胡索酸具有抑制CaiA酶活性的作用，特別是在三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）過程中產(chǎn)生的延胡索酸可以作為電子受體來抑制caiA基因（表達(dá)巴豆甜菜堿CoA還原酶CaiA）的表達(dá)。菌體內(nèi)L-肉堿的生成是一種耗能過程，而基因aceK與aceA基因分別編碼阻遏異檸檬酸脫氫酶活性的蛋白和異檸檬酸裂解酶，兩種酶對TCA循環(huán)都不利，因此在實驗中通過敲除這兩種基因來促使TCA循環(huán)的順利進(jìn)行，產(chǎn)生較多的能量[30]。另外，有研究者用人工合成的啟動子p37替換了內(nèi)源性啟動子pcai后，可以消除E. coli BW25113菌的厭氧依賴性，最終得到BWΔaceK ΔcaiA p37cai突變體，它幾乎能使底物達(dá)到完全轉(zhuǎn)化的水平[30]。

在菌體轉(zhuǎn)化過程中通過對一些文獻(xiàn)中的實驗結(jié)果比較來看，用休止細(xì)胞生產(chǎn)L-肉堿好于用生長細(xì)胞，一種休止細(xì)胞的固定方法是將培養(yǎng)后的菌體與卡拉膠溶液和KCl溶液硬化制備而成，固定化細(xì)胞可反復(fù)利用，從而能降低成本的投入[36]。報道的上述大腸桿菌野生型BW25113在含有延胡索酸的培養(yǎng)基中經(jīng)厭氧生長后，收集菌體轉(zhuǎn)移到含有50 mmol/L巴豆甜菜堿的磷酸鹽溶液中，產(chǎn)率可達(dá)4.6 g/（L·h），而通過基因改造得到的突變株BWΔaceK ΔcaiA p37cai的產(chǎn)率約為10 g/（L·h）左右[30]。

2.3利用γ-丁基甜菜堿為底物轉(zhuǎn)化生成L-肉堿

γ-丁基甜菜堿是L-肉堿生物合成的直接前體，在動物體內(nèi)由賴氨酸、甲硫氨酸等物質(zhì)轉(zhuǎn)化合成。圖5顯示了微生物利用γ-丁基甜菜堿為底物，經(jīng)過底物-CoA合成酶、CoA脫氫酶和CoA水解酶等幾步反應(yīng)得到L-肉堿的途徑，虛線框內(nèi)表示假單胞菌利用γ-丁基甜菜堿在γ-丁基甜菜堿羥化酶（gamma-butyl betaine hydroxylase，BBH）的作用下生成L-肉堿的過程[37]。

早在21世紀(jì)80年代初就有人選育出將γ-丁基甜菜堿高效轉(zhuǎn)化為L-肉堿的菌株，轉(zhuǎn)化率可達(dá)99%以上。1992年瑞士Hoeks等[38]報道了突變株HK1349在400 L反應(yīng)器中試規(guī)模下，用細(xì)胞循環(huán)方法連續(xù)轉(zhuǎn)化γ-丁基甜菜堿底物制備L-肉堿，其轉(zhuǎn)化率能保持在95%以上，同年中山清等也篩選到無色桿菌、假單胞菌屬的微生物也具有將γ-丁基甜菜堿生成L-肉堿的能力。盡管通過γ-丁基甜菜堿轉(zhuǎn)化來生產(chǎn)L-肉堿的轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)量都較高，但γ-丁基甜菜堿本身價格昂貴，成本高，且用此法生產(chǎn)L-肉堿過程中，還需要很多輔助因素，因此在工業(yè)化生產(chǎn)中有一定難度，但用它作為前體物得到的轉(zhuǎn)化率是目前最高的，目前也有一種方法用巴豆甜菜堿在其還原酶的作用下生成γ-丁基甜菜堿的合成方法正在研究。

很多業(yè)主挑選越厚越重的瓷磚是覺得它的強度和抗折性更好。瓷磚的強度取決于它的密度，而不全在于它的厚薄。目前，國際建筑陶瓷產(chǎn)品的發(fā)展方向是輕、薄、結(jié)實、耐用、個性化。鑒別瓷磚強度的高低，可查看瓷磚背面顆粒的細(xì)膩程度。一般情況下，瓷磚顆粒越細(xì)膩，致密度越高，其破壞強度就越高。

圖5微生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化γ-丁基甜菜堿生成L-肉堿的途徑Fig.5Biotransformation pathway fromγ-butyrobetaine to L-carnitine in bacteria

2.4利用D-肉堿為底物轉(zhuǎn)化生成L-肉堿

從D-肉堿到L-肉堿可以有兩種方法，一種是直接在肉堿消旋酶的作用下相互轉(zhuǎn)化生成，另一種是在D-肉堿脫氫酶和L-肉堿脫氫酶共同作用下，首先在D-肉堿脫氫酶的作用下將D-肉堿轉(zhuǎn)化為3-脫氫肉堿，然后由L-肉堿脫氫酶進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為L-肉堿[39]。如：國外已有專利稱E. coli O44 K74中存在著一種由caiD基因編碼的肉堿消旋酶能將D-肉堿直接轉(zhuǎn)化為L-肉堿，此方法的弊端是制備得到的L-肉堿中D-肉堿的轉(zhuǎn)化率必須接近100%，否則此方法不具備產(chǎn)業(yè)化價值[31]。

3　3L-肉堿的檢測方法

L-肉堿的檢測也是在使用L-肉堿過程中的一個主要環(huán)節(jié)。據(jù)目前報道，瘦肉類產(chǎn)品是L-肉堿的最好來源，奶制品及海鮮中含量相對較低，在果蔬中的含量幾乎為零，所以對一些素食者來說，必需定時的補充L-肉堿才能保證體內(nèi)的L-肉堿不缺乏從而避免代謝疾病[3]。在醫(yī)療方面，L-肉堿及肉堿脂的檢測對有關(guān)脂肪代謝疾病的治療起著重要作用；在制藥方面，由于D-肉堿是L-肉堿的競爭性抑制劑，甚至具有毒性作用，所以在L-肉堿的濃度及純度檢測方面提出了很高的要求，要求檢測方法具有高效性、安全性和準(zhǔn)確性。本文主要闡述以下幾種檢測方法：酶法（兼紫外-可見分光光度計法）、色譜法、質(zhì)譜法、電泳法、電化學(xué)法、放射分析法。

3.1酶法檢測

L-肉堿的酶法檢測法是Marquis等[40]于1964年建立的，其原理是在HEPES-EDTA緩沖體系中乙酰輔酶A首先與L-肉堿在肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（carnitine acetyltransferase，CAT）的作用下生成游離輔酶A，生成的輔酶A與巰基試劑5,5’二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithio bis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB）反應(yīng)生成黃色的TNB-，TNB-在412 nm波長處有很強的吸收峰，且輔酶A與L-肉堿之間是等摩爾關(guān)系，所以利用比色法于412 nm波長處測定即可間接測定出L-肉堿的含量，有關(guān)反應(yīng)式：

此反應(yīng)須具備兩個條件：1）有較多的乙酰輔酶A能與L-肉堿反應(yīng)；2）加入的CAT和DTNB量恒定。

此法具有諸多優(yōu)點：1）緩沖液HEPES-EDTA提供了一個良好的緩沖體系，使反應(yīng)環(huán)境很好的保持在pH 8.0中，因為當(dāng)pH＞8.0時，乙酰輔酶A本身就會分解產(chǎn)生輔酶A，從而使412 nm波長處的吸光度增加；2）靈敏度較高，檢測限可達(dá)到5 nmol；3）重復(fù)性和回收率較好，肉堿的回收率在97.5%以上。此法的不足之處：DTNB作為巰基試劑，與菌體中任何含巰基物存在的CoASH均可反應(yīng)而使吸光度增加，此外涉及到的酶和催化劑都是比較昂貴的試劑[41-42]。

3.2色譜法檢測

L-肉堿的色譜法檢測有高效液相色譜法（highperformance liquid chromatography，HPLC）和氣相色譜法，色譜法具有檢測速度快、高靈敏度和高準(zhǔn)確性的特點。

3.2.1高效液相色譜法檢測

由于DTNB法容易受硫醇物質(zhì)的影響，所以有人采用HPLC法直接檢測L-肉堿的含量。用C18柱和C8柱可以分離γ-丁基甜菜堿和L-肉堿，但不能分離巴豆甜菜堿和L-肉堿，因此有學(xué)者研究采用衍生HPLC法，即首先將樣品用衍生試劑處理后再進(jìn)行HPLC測定，使用硅膠柱就可以成功地將游離肉堿、乙酰肉堿、丙酰肉堿、己酰肉堿、辛酰肉堿和總?cè)鈮A等分開[43]。HPLC具有的高精密度、高準(zhǔn)確度和高靈敏度等特點而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)方面的L-肉堿分析。

3.2.2氣相色譜法

Monika等[3]建立的氣相色譜測定方法的原理是將含有NaOH和NaBH4的肉堿化合物經(jīng)過160 ℃高溫分解后，再進(jìn)行測定。

3.3質(zhì)譜法

質(zhì)譜法是用來分析許多未知化合物中的成分，從而確定物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)組分。過去10年內(nèi)，串聯(lián)質(zhì)譜法因其較高的靈敏性和準(zhǔn)確性而很受歡迎。但由于質(zhì)譜儀昂貴的價格而還未完全普及到實驗室，所以一般在先天性代謝缺陷病的鑒定中使用[44-45]。

3.4放射性分析法

放射性分析法是一種非常靈敏的方法，但有放射性同位素，因此對其操作方法和環(huán)境有著嚴(yán)格的要求，此法是在酶促反應(yīng)中將游離的肉堿轉(zhuǎn)變成含有放射性的乙酰肉堿來進(jìn)行檢測?？?cè)鈮A也需要通過堿水解后生成乙酰肉堿來測定，因此游離肉堿和總?cè)鈮A水解后計算的乙酰肉堿濃度會不同。Seline等[46]對此法做了進(jìn)一步驗證，其參數(shù)包括殘留的現(xiàn)象、測定時存在的一些非肉堿放射性物質(zhì)等，此方法可被用于測定肉類和蔬菜類中的總?cè)鈮A、游離肉堿和乙酰肉堿的量。目前西方一些國家報道：已將此法應(yīng)用在了各種食品中L-肉堿的測定，包括肉類、奶制品和果蔬等日常消費品方面，測定方法是在含有Tris-HCl（pH 7.3）、連四硫酸鈉、[3H-甲基]乙酰CoA和肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的混合液中加入樣品，37 ℃反應(yīng)后，再裝入Dowex樹脂管中4 ℃溫浴，上清液中就會產(chǎn)生含有亮點物質(zhì)的混合溶液，用閃爍計數(shù)器即可計算，計算出鮮牛肉中的含量為40～540 μmol/100 g，牛奶中26 μmol/100 mL[47]。

3.5電泳法

在普遍的色譜分析技術(shù)中，電泳法也有其優(yōu)勢，但與HPLC相比，其很少被應(yīng)用到，電泳法檢測系統(tǒng)與紫外分光檢測有著直接或間接的聯(lián)系。一種電泳法測定L-肉堿的方法是在含有奎寧的緩沖體系中間接測定L-肉堿量，而不需要復(fù)雜的衍生化反應(yīng)[48-49]。

3.6電化學(xué)法

電化學(xué)分析開創(chuàng)了用不同的連續(xù)系統(tǒng)來同時分析各種化合物的可能性，且這些連續(xù)系統(tǒng)是以具有良好精度的電化學(xué)傳感器作為探測器的，目前報道的有流動注射分析儀（fl ow injection analysis，F(xiàn)IA）技術(shù)和順序注射分析（sequential injection analysis，SIA）技術(shù)[3]。

此外，朱加進(jìn)等[50]發(fā)現(xiàn)用酶聯(lián)高效液相色譜儀法能更好的避免硫醇物質(zhì)的影響，也可以準(zhǔn)確的檢測出L-肉堿而不受D-肉堿的影響，此法簡單的原理是在酶法反應(yīng)的第一步結(jié)束后無需加入DTNB，生成的中間物CoASH直接用高效液相色譜儀測定，從而間接計算出L-肉堿的量。

目前，國內(nèi)采用的檢測方法也有多種，比如鄭璞等[41]用酶法測定微生物中的L-肉堿量；趙亞明等[51]用高效液相色譜法檢測血漿中的L-肉堿量；竺琴等[52]用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)法用測定了嬰幼兒配方奶粉中的左旋肉堿量。

4　結(jié)語

L-肉堿在脂肪氧化過程中起重要的載體作用，對神經(jīng)類疾病有良好的預(yù)防作用，并且有一定的抗氧化作用。目前L-肉堿的巨大市場需求對其生產(chǎn)方法和技術(shù)提出了更高的要求，許多研究者都在探索除化學(xué)合成法之外更先進(jìn)、安全、高效的方法。L-肉堿的生物制備方法主要有直接提取法、微生物發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法等，而從生物組織直接提取L-肉堿的方法具有含量低、成本高的特點而難以得到推廣。因許多微生物中存在L-肉堿，比如酵母菌、曲霉、青霉、根霉等，將這些微生物通過液體深層培養(yǎng)或固體發(fā)酵，可以積累L-肉堿，雖然目前通過發(fā)酵得到L-肉堿的水平還比較低，但此法是最具研究價值和應(yīng)用潛力的制備方法。目前也只有瑞士、意大利和日本等實現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)，我國利用生物法制備L-肉堿的研究起步較晚，尚未形成商業(yè)化，因此利用微生物生產(chǎn)L-肉堿與檢測L-肉堿的精確方法都需亟待研究，對增加我國在此領(lǐng)域的知識產(chǎn)權(quán)優(yōu)勢具有重要意義。國內(nèi)

L-肉堿問世以后，將部分或完全替代進(jìn)口，并進(jìn)一步擴大其應(yīng)用范圍，推廣前景十分看好。

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Advances in Physiological Functions，Biotransformation and Detection of L-Carnitine

YANG Yueying1，HUANG Jiaofang2，3，GU Jinjie2，SHI Jiping2，WANG Hongying1，*
（1.College of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian116034，China；2.Laboratory of Biorefinery，Shanghai Advanced Research Institute，Chinese Academy of Sciences，Shanghai201210，China；3.Integrative Bio-inspired Molecular Engineering Laboratory，School of Physical Science and Technology，ShanghaiTech University，Shanghai201210，China）

L-Carnitine，also named vitamin BT，is an active compound found in animals and vegetal tissues，as well as in micr oorganisms. L-carnitine plays an important role in fatty acid metabolism.In recent years，L-carnitine has been increasingly used as a novel food additive and clinically applied in reducing blood fat，so that the demand for L-carnitine is increasing in the worldwide market，and the development of manufacturing and detection methods is needed.Herein，the physiological functions，biotransformation and detection methods of L-carnitine are summarized，and the future directions of L-carnitine are put forward in this review.

L-carnitine; fatty acid metabolism; biotransformation; active isomer; detection

TS201.2

A

1002-6630（2015）05-0205-07

10.7506/spkx1002-6630-201505039

2014-05-09

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31400042）

楊月英（1989—），女，碩士研究生，研究方向為微生物基因工程。E-mail：qhyyy0323@163.com

王紅英（1968—），女，副教授，碩士，研究方向為微生物資源利用。E-mail：2002wanghongying@163.com