曾長英 周玉飛 彭明

miRNA（microRNA）是近年來在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內源、不編碼蛋白、長度為 20-24 nt的單鏈小分子 RNA［1］。miRNA能與靶mRNA分子的3'UTR區(qū)特異性配對，引起靶mRNA的降解或者抑制其翻譯，從而實現(xiàn)對靶基因在轉錄后水平上的負向調控［2］。miR319最初是通過對jaw-D基因突變體的正向遺傳分析發(fā)現(xiàn)的，它可通過靶向TCP轉錄因子來調控植物葉片的形態(tài)建成與生長發(fā)育［3］。過表達miR319基因會引起植物表型變化，包括植物葉片邊緣鋸齒化、果實畸形、葉片向上生長等一系列異常的表型［4］。Schommer［5］進一步發(fā)現(xiàn) miR319 還可調控茉莉酸生物合成，從而調控植物葉片的衰老進程。此外，miR319還在花瓣和雄蕊的發(fā)育過程中起著關鍵的調控作用，如miR319a成熟序列的一個堿基發(fā)生突變，會導致miR319功能缺失，引起花瓣變短變窄、雄蕊變短等［6］。

在低溫脅迫下，Sunkar 等［7］發(fā)現(xiàn) miR393和miR319c在擬南芥冷害下強烈上調表達；賈蓓［8］通過基因芯片在水稻中發(fā)現(xiàn)miR319a/b在低溫處理0.5h即有表達量的下調。Wang等［9］進一步發(fā)現(xiàn)過量表達miR319b能提高轉基因水稻的耐低溫能力，同時提升轉基因植株的脯氨酸含量和逆境后的成活率。與此同時，其靶基因OsPCF6和OsTCP21在轉基因植株中下調表達，推測miR319b可能是通過活性氧的清除實現(xiàn)耐低溫能力的提升。

木薯是典型的熱帶塊根作物，其耐低溫能力及特性與擬南芥及以種子為收獲目標的水稻可能存在差異，本研究旨在針對miR319在木薯低溫脅迫過程的響應特點做初步的探索。

1 材料與方法

1.1 材料

木薯品種SC124和C4。

1.2 方法

在室外大田采用種莖繁殖的方法將木薯SC124和C4種植在體積為3 L的塑料盆，每周澆施1/4濃度的霍格蘭大量元素營養(yǎng)液和阿農微量元素營養(yǎng)液，常規(guī)病蟲害管理3個月后，將盆栽苗移到SANYO人工氣候培養(yǎng)箱內進行低溫處理。實驗共設置4個處理：馴化處理（acclimation treatment，AT：25℃梯度降溫至14℃后開始計時）；馴化后寒害（acclimation hurt，AH：在經歷5 d馴化處理后再由14℃梯度降溫至4℃）；非馴化寒害（nonacclimation hurt，NAH ：25℃ 直接降溫 至 4℃） 和對 照（negative control，NC： 一 直 維 持 25℃ 的溫度）。

4個處理的前中后3個時間點的功能葉混合成4個樣品：NC（0 d、5 d和 10 d），AT（6h、24h和5 d），AH（6h、24h和 5 d）和 NAH（6h、24h和5 d），這4個樣品抽提的RNA同時用于小RNA的定量分析和靶基因的定量分析。miRNA的RT-PCR檢 測 參 考 Wang 等［10］的 Multiplexed RT-PCR 方法，內參基因為U6，靶基因的特異引物設置在跨越miRNA與靶基因結合區(qū)的前端（5'端）和后端（3'端），內參基因為Actin。

2 結果

2.1 miR319與其靶基因在SC124的4個處理轉錄組中的消長關系

前期對SC124的4個處理中的根莖葉混合樣品進行了小RNA測序和轉錄組測序，兩組數(shù)據(jù)中miR319a與其靶基因之間的表達量關系如表1所示：miR319在NAH中相對于NC來說下調表達了6.6倍，4個靶基因則是上調表達7-155倍之多，涉及的基因有MYB33、TCP4、GSTU8及一個未知功能基因（以下簡稱Unknown）。而在其他兩個低溫處理與對照的比較中未發(fā)現(xiàn)miR319與其靶基因在表達量上存在消長關系。

表1 miR319與其靶基因在NAH下表達量上的消長關系

2.1 miRNA在兩個木薯品種中的不同響應特征

選取每個處理前中后3個時間點功能葉混合樣品對miR319a做的定量分析，結果（圖1-A）顯示，miR319a在C4和SC124兩個品種中的4個處理的響應模式一致，均呈“反Z”型。4個處理的兩兩比較分析（圖1-B）表明，SC124的變化幅度顯著大于C4相應處理間的表達量變化，尤其是在包含NAH處理的比較中，如NAH/NC和NAH/AT，兩品種間的差異最大（圖1-B中兩曲線中間的間隔寬度，分別為2.269和3.21），而在AT/NC（0.941）和AH/NC（0.937）中的差距則要小許多。這一結果與小RNA測序結果中僅在NAH中差異表達較大相一致。

圖1 四個處理條件下miR319a與內參基因U6的相對表達量（A）及兩兩處理間的相對表達量（B）

2.2 miRNA與其靶基因在3個低溫脅迫下的不同響應

結合miR319與其4個靶基因在同一套樣品中的表達量變化（圖2）顯示，miR319在C4和SC124兩個品種的NAH處理中都具有明顯此消彼長的關系，這與轉錄組數(shù)據(jù)相一致，且兩品種間的變化趨勢相反，說明這一miRNA表達量上的差異可能在這兩個木薯品種的耐低溫能力差異上起著重要作用。而在AH處理下，尤其是AT處理下無明顯的規(guī)律。

圖2 miR319a與4個靶基因在C4和SC124兩個品種之間的表達模式

2.3 miRNA與靶基因之間的相關性分析

將4個處理中miR319a及其靶基因與NC的相對表達量進行散點圖分析（圖3），可得出以下擬合方程，miR319a與靶基因之間的相關系數(shù)表現(xiàn)出一定的變化：C4中miR319a與3個靶基因（TCP4、MYB33和Unknown）的相關系數(shù)均大于SC124中miR319a與相應靶基因的相關系數(shù)，而miR319a與GSTU8（5766）的相關系數(shù)卻是在SC124中大于C4中的相關系數(shù)。miR319與靶基因的相關系數(shù)及R2值在兩個品種中從大到小的順序一致，依次為MYB33＞Unknown＞TCP4＞GSTU8。

圖3 miR319a與其靶基因在兩個品種中4個處理間的相關性分析

3 討論

miRNA在植物中一般是通過對其靶基因的mRNA進行剪切，從而實現(xiàn)其對靶基因的負向調控，從我們的研究結果可以看出，剪切是具有時間、部位、處理方式及品種特異性。本研究發(fā)現(xiàn)miR319a在C4和SC124兩個木薯耐低溫能力不同的品種中的4個低溫脅迫處理表現(xiàn)大體一致，且在SC124中的變化幅度要大于C4中的變化幅度，尤其是在NAH（從正常的25℃直接降到4℃的非馴化低溫傷害處理）中兩個品種的差別最大。由此可見，miR319a在未經過馴化的NAH下品種差異最大，而通過14℃的馴化處理（包括AT和AH），miR319所介導的靶基因調控在兩個品種低溫響應模式趨于一致。前期表型分析結果發(fā)現(xiàn)，在NAH處理下木薯植株在4個低溫處理中低溫傷害最顯著，且SC124的表型傷害要重于C4的低溫傷害［11］，說明NAH處理下兩品種miR319a表達量變化某種程度上表征了木薯低溫脅迫的程度。

miR319是目前研究比較深入的植物miRNA，它的靶基因涉及TCP轉錄因子和MYB轉錄因子，調控著植物葉和花的發(fā)育及葉片的衰老。前人研究證明在葉的發(fā)育階段，靶基因TCP轉錄因子負調控葉的發(fā)育進程，而在葉片的衰老階段，靶TCP轉錄因子正向調控葉的衰老進程［5，12］。這個現(xiàn)象與木薯miR319a在低溫脅迫傷害表現(xiàn)最明顯的NAH處理中呈現(xiàn)出與靶基因明顯的消長關系不謀而合，因為在NAH處理中的低溫傷害中大量的葉片出現(xiàn)黃化、萎蔫，甚至干枯掉落，是明顯的衰老過程。而對于AT和AH這兩個經歷了14℃亞低溫馴化過程的處理來說，明顯削弱了miR319對衰老的正向促進作用，起到一種類似于延緩衰老的客觀效果，這與亞低溫馴化減輕低溫脅迫傷害的生產實踐經驗也是一致的。

由miR319a與4個不同靶基因的表達量的擬合方程來看，擬合方程的斜率（即相關系數(shù)）和R2值（即擬合程度）都不是很顯著，原因之一可能是：僅依靠miR319a一個成員與其4個共同的靶基因做消長關系的擬合方程可能會發(fā)生信息轉換的不準確。因為 miR319家族中有 miR319a、miR319b、miR319c等3個成員，且3個成員在葉的生長發(fā)育中發(fā)揮著截然不同的功能［6］，表達水平各不相同且有部分重疊，解決辦法是用更為特異的stem-loop方法準確定量miR319的3個不同成員的表達量變化，進而區(qū)分哪個miR319成員在哪個處理下與哪個靶基因之間具有明顯的消長關系。

miR319a與4個不同靶基因表達量的擬合方程中的相關系數(shù)表明，與miR319a相關系數(shù)從大到小的靶基因依次為MYB33＞Unknown＞TCP4＞GSTU8。本研究組前期工作發(fā)現(xiàn)，在木薯低溫脅迫的NAH處理中檢測到miR319a對TCP4（4517）在miRNA與mRNA結合區(qū)的第8個堿基處有剪切作用，但miR319的另外一個基因GSTU8（5766）與miR319匹配區(qū)內未檢測miR319a對它的剪切事件［13］。這進一步驗證了miR319a與TCP4的擬合方程中的相關系數(shù)（-2.793，R2為0.136）也顯著大于miR319a與GSTU8的相關系數(shù)（-0.091，R2為0.104）。此外，我們還發(fā)現(xiàn)比經典靶基因TCP4，與miR319a的相關系數(shù)更高的有MYB33和功能未知基因（021030 m）兩個靶基因，預示著miR319的靶基因MYB33和Unknown處于更為優(yōu)先的調控目標，MYB33作為miR319的靶基因主要在花的發(fā)育過程中起著重要的調控作用，如影響植物雄蕊的育性［14］。但miR319對MYB33和Unknown的調控作用在木薯的低溫逆境適應性過程中起著怎樣的作用，是下一步值得深入研究的問題。

4 結論

成功克隆并報道了miR319a及其4個不同靶基因在兩個木薯品種低溫脅迫的響應特征，通過miRNA與靶基因之間在不同低溫處理間的比較分析表 明，miR319a對 MYB33和Unknown（021030m）兩個靶基因的調控在木薯的低溫適應性上有著重要作用，是木薯低溫適應性遺傳改良的重要候選基因。

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