周琪 羅春 郭敏 付暢

不利的環(huán)境條件會影響植物的生長發(fā)育，導致作物的產(chǎn)量降低，大于50％的作物減產(chǎn)是由非生物脅迫引起的［1］，其中日益嚴重的土壤鹽漬化是主要的影響因素之一。植物耐鹽基因工程是提高植物耐鹽性的重要途徑之一，但其前提基礎是充分了解植物的耐鹽分子機制，獲得重要的耐鹽工具基因。盡管目前植物耐鹽基因工程取得了很多進展［2-6］，分離到一些耐鹽相關基因，獲得一些耐鹽性得到提高的轉基因植物，但是，這些轉基因植物的耐鹽性仍然很有限。植物耐鹽機制研究的不足，有效耐鹽工具基因的缺乏已成為影響植物耐鹽基因工程發(fā)展的主要障礙［7］。鹽生植物星星草（Puccinellia tenuiflora）具有較強的耐鹽能力，擁有豐富的耐鹽基因資源，是研究植物耐鹽分子機制的良好材料。星星草是禾本科堿矛屬單子葉鹽生草本植物，耐受NaCl的最高濃度可以達到600mmol/L，耐受Na2CO3的濃度可以達到200mmol /L［8］，能在pH9-10以上的鹽堿地上生長發(fā)育［9］。

類 光 誘 導 蛋 白 1（Light regulated protein 1，LIR1）基因LIR1與植物的抗逆性密切相關，LIR1在生長于鹽堿地的星星草根中表達［10］，在400mmol/L NaHCO3脅迫 6h后于星星草葉中表達［11］。梁涵等［12］以 100mmol/L NaCl處 理 虎 尾 草（Chloris virgata）后，類光誘導蛋白1基因LIR1上調表達。在條銹菌CY31侵染早期，類光誘導蛋白1基因LIR1在小麥（Triticum aestivum）品種水源11中表達［13］。這些研究結果表明，LIR1基因參與植物對多種逆境脅迫的應答，可能在植物的耐鹽性中發(fā)揮重要作用。類光誘導蛋白1基因LIR1可能協(xié)助光合作用的進行或光合作用產(chǎn)物的加工［14］，而可溶性糖的存在是該過程的負調控因子［15］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中可溶性糖會抑制類光誘導蛋白1基因的表達［16］。寒冷脅迫下黑麥草（Lolium perenne）類光誘導蛋白1基因LpLIR1先上調表達后下降到本底水平，表達水平的下降可能與可溶性糖的積累有關［15］。此外，類光誘導蛋白1基因還可能與蔗糖水平的調節(jié)有關［15］。

在前期的研究中，我們從鹽堿地星星草根的消減雜交cDNA文庫中分離到PtLIR1基因的表達序列標簽（expression sequence tag，EST）［10］，表明該基因可能在幫助星星草根抵御鹽堿地逆境的過程中發(fā)揮重要作用。為了進一步了解該基因在星星草根中響應鹽脅迫的分子機制，本研究從星星草中克隆PtLIR1基因，分析NaCl脅迫下PtLIR1基因的表達特性，并對PtLIR1基因表達與蔗糖水平、可溶性糖水平的相關性進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 以采自肇東鹽堿地的星星草根和溫室培養(yǎng)的星星草幼苗為實驗材料。

1.1.2 主要試劑 pMD19-T Simple載體（大連寶生物工程有限公司），大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109（大連寶生物工程有限公司），PrimeScriptTMRT reagent Kit （Perfect Real Time）及SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（大連寶生物工程有限公司），RNA清潔純化試劑盒（天津原平皓生物技術有限公司），膠回收試劑盒（上海生工生物工程公司）。

1.2 方法

1.2.1 星星草的培養(yǎng)與處理 以采自肇東鹽堿地的星星草根為材料克隆PtLIR1基因。以溫室培養(yǎng)的星星草幼苗為材料進行基因表達分析。將星星草種子萌發(fā)后種植在盛有草炭土和細沙（2 1）花盆中，溫室培養(yǎng)8周，以300mmol/L NaCl分別脅迫星星草幼苗0、6、12、24和48h，將根和地上部分開，液氮速凍后于-70℃貯存，用于熒光半定量RT-PCR分析。

1.2.2 星星草PtLIR1基因的克隆 以前期研究中分離到的星星草PtLIR1基因的EST序列為信息探針，在NCBI GenBank EST數(shù)據(jù)庫中檢索到星星草PtLIR1基因的EST序列EB104311.1，經(jīng)生物信息學分析發(fā)現(xiàn)該EST序列含有完整的PtLIR1基因的開放讀碼框（ORF），根據(jù)該序列設計一對引物（PtLIR1-F1：5'-GTCGACATGCAGGCTGCCACTGGTTTG-3'，劃線部分為Sal I酶切位點；PtLIR1-R1：5'-CCATGGTTA CTCCTTGGAGACTCCCGTCTG-3'，劃線部分為Nco I酶切位點）。采用SDS-苯酚法從鹽堿地星星草根中提取總RNA，經(jīng)DNaseⅠ去除基因組DNA污染以及RNA清潔純化試劑盒純化后，將總RNA反轉錄成cDNA，以此為模板以引物PtLIR1-F和PtLIR1-R1對星星草PtLIR1基因的ORF進行PCR擴增。PtLIR1基因的 PCR 反應體系為：2.5μL 10×PCR緩 沖 液，2μL dNTP（2.5mmol/L），PtLIR1-F（10μmol/L）和 PtLIR1-R1（10μmol/L）各 1μL，2μL cDNA，0.25μL rTaq（5U/μL），加滅菌的去離子水至 25μL。PCR 反應條件為：94℃ 預變性 4min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，共 35 個循環(huán) ；最后72℃ 延伸10min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析后將擴增片段用膠回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物與到pMD19-T Simple載體連接后轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109。采用Amp抗性和藍白斑反應篩選陽性重組子，送上海生工生物工程公司測序。插入片段的序列與預期相符，陽性重組質粒命名為pT-PtLIR1。

1.2.3 NaCl脅迫下星星草PtLIR1基因的表達特性分析 分別提取NaCl處理后的星星草根和葉的總RNA，經(jīng)DNA酶消化以及純化后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，用核酸蛋白檢測儀定量。采用熒光定量RT-PCR分析NaCl脅迫下PtLIR1基因的表達變化。取400 ng總RNA用PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）將其反轉錄成cDNA。反轉錄體系為 ：2μL 5×PrimeSctipt Buffer（for Real Time），0.5μL PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ，0.5μL Oligo dT Primer（50μmol/L），0.5μL Random 6 mers（50μmol/L），加滅菌的去離子水至10μL。反轉錄條件為：37℃ 15min，85℃ 15s，4℃保存。以 cDNA為模板，用SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）進行熒光定量RT-PCR分析。引物Pttubulin-F：5'-CGACTTGGCAAAGGTTCAGC-3'和 Pttubulin-R：5'-TCATCGCCCTCATCATCTGC-3'擴增Pttubulin基因，用引物PtLIR1-F1和PtLIR1-R1 擴增PtLIR1基因。PCR 反 應 體 系 為 ：10μL 2× 的 SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus），F(xiàn)orward Primer（10μmol/L）和 Reverse Primer（10μmol/L）各 0.8μL，2μL cDNA，加滅菌的去離子水至20μL。PCR反應條件為 ：95℃ 5min ；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共44個循環(huán)。目的基因的相對含量=2-??CT，其中??CT=? CT樣本 -? CT對照，? CT樣本 = CT樣本 -CT內參，? CT對照= CT對照-CT內參。PtLIR1基因表達的器官特異性分析采用半定量RT-PCR方法。

1.2.4 生物信息學分析 用DNAman軟件進行氨基酸序列分析，采用ClustalX1.8軟件進行序列比對，用Mega4.0.2軟件生成進化樹。

2 結果

2.1 星星草PtLIR1基因的克隆

以前期研究中分離到的星星草PtLIR1基因的EST序列為信息探針，從NCBI GenBank EST 數(shù)據(jù)庫中檢索到星星草PtLIR1的EST序列EB104311.1，經(jīng)ORF Finder 軟件分析后發(fā)現(xiàn)該EST中含有PtLIR1基因完整的ORF。根據(jù)ORF序列設計一對引物（PtLIR1-F1和PtLIR1-R1），提取并純化鹽堿地星星草根的總RNA，將其反轉錄成cDNA后作為模板，擴增PtLIR1基因的ORF（圖1）。將擴增產(chǎn)物克隆后，經(jīng)測序分析證實該擴增片段與預期的PtLIR1基因的ORF一致（GenBank登錄號為JN871224）。

圖1 星星草PtLIR1基因ORF擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測

2.2 星星草PtLIR1基因的生物信息學分析

星星草PtLIR1基因的開放讀碼框長為408bp，編碼135個氨基酸。BlastX分析表明，PtLIR1基因編碼的氨基酸序列與類光誘導蛋白1的匹配最佳。經(jīng)過ProtParam計算，PtLIR1的分子量為14.1kD、理論上的等電點值為4.45。在NCBI GenBank蛋白質數(shù)據(jù)庫中選取黑麥草、二穗短柄草、玉米、短花藥野生稻、粟、馬鈴薯、葡萄、蕪青、擬南芥、小鹽芥、水稻、大豆等植物LIR1氨基酸序列，與星星草PtLIR1進行了序列一致性比對，結果（圖2）表明，PtLIR1的氨基酸序列與黑麥草的類光誘導蛋白1的一致性最高，為80％。PtLIR1與水稻、玉米、蕪青、小鹽芥、擬南芥、短花藥野生稻、粟、馬鈴薯、葡萄、二穗短柄草和大豆等植物的LIR1的一致性分別為57％、72％、42％、42％、54％、57％、71％、61％、67％、64％和47％。在相似性比較結果的基礎上構建了LIR1的分子進化樹（圖3），在比較的物種中，PtLIR1與黑麥草類光誘導蛋白1的親緣關系最近。PtLIR1具有光誘導蛋白結構域。與其他光誘導蛋白相似，在PtLIR1的56-70和110-124位氨基酸序列中存在兩個近似重復序列，形成α-螺旋結構，在重復序列內半胱氨酸殘基之間的距離高度保守（8個氨基酸殘基）。PtLIR1的重復序列與其他植物相似性較高，而重復序列外的相似性則較低，表明該結構域具有重要功能。

2.3 NaCl脅迫下星星草PtLIR1基因表達特性分析

2.3.1 NaCl脅迫下星星草PtLIR1基因表達的器官特異性分析 類光誘導蛋白1基因LIR1與植物的抗逆性密切相關，參與植物對鹽脅迫［13-15］、寒冷脅迫［11］和病害［16］的應答反應。為了了解鹽脅迫下星星草PtLIR1基因表達的器官特異性，利用半定量RT-PCR技術檢測了PtLIR1基因在星星草根與葉中的表達（圖4）。無論在非脅迫條件下還是在鹽脅迫條件下，PtLIR1基因在星星草的根與葉中均表達，PtLIR1基因在鹽堿地星星草根中的表達量明顯高于PtLIR1在其它條件下星星草根中的表達量，表明PtLIR1基因可能對星星草根適應鹽堿地生境具有特別重要的意義。

2.3.2 NaCl脅迫下星星草根中PtLIR1基因的表達與體內蔗糖水平的相關性 為了了解星星草根中PtLIR1基因對NaCl脅迫的響應，以Pttubulin基因作為內參基因，利用熒光定量RT-PCR技術分析了NaCl脅迫下星星草根中PtLIR1基因相對表達水平的變化（圖5）。NaCl脅迫下PtLIR1基因在星星草根中的表達水平先下降后上升，在脅迫24h后達到峰值（為0h的2.4倍），隨后又下降。PtLIR1基因在NaCl脅迫24h時上調表達，表明PtLIR1基因在脅迫晚期（12-48h）參與星星草根對NaCl脅迫的應答，并可能對幫助星星草根抵御鹽堿地逆境中的NaCl脅迫具有重要作用。

圖3 植物LIR1氨基酸序列的分子進化樹

圖4 星星草PtLIR1基因表達的器官特異性分析

蔗糖的積累是植物抵御逆境脅迫的機制之一，而類光誘導蛋白1基因LIR1可能參與對蔗糖水平的調節(jié)［11］。LIR1基因可能通過調節(jié)蔗糖水平參與植物對鹽脅迫的應答。NaCl脅迫下星星草根中的蔗糖水平在脅迫6h后上升，在24h后達到峰值（圖5），表明蔗糖的積累是星星草根響應鹽脅迫的策略之一。在NaCl脅迫早期（0-12h），PtLIR1基因的表達與蔗糖水平的變化趨勢相反，而在脅迫晚期（12-48h），PtLIR1基因的表達與蔗糖水平的變化趨勢一致。結果表明，在NaCl脅迫晚期，PtLIR1基因的表達與蔗糖水平的變化具有正相關性，可能是參與調節(jié)蔗糖水平的主要基因，而在脅迫早期，其他蔗糖代謝調節(jié)基因可能在蔗糖水平的調節(jié)中發(fā)揮主要作用。

圖5 NaCl脅迫下星星草根中PtLIR1基因的表達與蔗糖含量的相關性

2.3.3 NaCl脅迫下可溶性糖與星星草根中PtLIR1基因表達的相關性 可溶性糖的積累也是植物適應逆境脅迫的機制之一。在擬南芥（A. thaliana）和黑麥草（L. perenne）中都發(fā)現(xiàn)了類光誘導蛋白1基因LIR1的表達會受到可溶性糖的抑制［11，12］。鹽脅迫下星星草根中LIR1的表達可能也受到可溶性糖的調節(jié)。NaCl脅迫下，星星草根中可溶性糖的水平在脅迫6h后達到峰值，但隨后呈現(xiàn)下降的變化趨勢（圖6），表明可溶性糖的積累是星星草根響應早期鹽脅迫的策略之一。在NaCl脅迫早期（0-12h），PtLIR1基因的表達與可溶性糖水平的變化趨勢相反。而在脅迫晚期（12-48h），PtLIR1基因的表達與可溶性糖水平的變化趨勢一致，但可溶性糖的水平低于脅迫早期（0-12h）（圖6）。結果表明，在NaCl脅迫早期星星草根中可溶性糖的積累與PtLIR1基因的表達水平負相關，這與擬南芥（Arabidopsis thaliana）類光誘導蛋白1基因的表達受到可溶性糖抑制的研究結果相一致［16］，星星草根中PtLIR1基因的表達可能受到可溶性糖積累的負調控。但在脅迫晚期（12-48h），低于早期的可溶性糖水平與PtLIR1基因的表達未呈現(xiàn)出負相關性。

圖6 NaCl脅迫下星星草根中PtLIR1基因的表達與可溶性糖含量的相關性

3 討論

鹽脅迫是影響植物生長發(fā)育，導致農作物減產(chǎn)的重要環(huán)境因子之一。植物具有一定的調節(jié)離子平衡、滲透平衡以及氧化還原平衡的能力，可以在一定程度上適應鹽脅迫逆境。鹽脅迫下可溶性糖和蔗糖的積累是植物適應逆境脅迫的機制之一［17，18］?？扇苄蕴鞘侵匾男》肿訚B透調節(jié)物質，是合成其它有機物質的碳架與能量來源。蔗糖可以作為滲透調節(jié)物質調節(jié)滲透平衡，可以維持細胞膜的穩(wěn)定性、保護細胞內的分子結構，是植物生長發(fā)育的重要碳源和能源，此外還具有信號功能，可以調節(jié)相關基因的表達［18］?？扇苄蕴呛驼崽谴x水平常被用來衡量逆境脅迫的程度以及植物對逆境脅迫的適應性。

類光誘導蛋白1基因LIR1與植物的抗逆性密切相關，參與植物對鹽脅迫、寒冷脅迫和病害脅迫的應答［10-13］。該基因可能協(xié)助光合作用的進行或光合作用產(chǎn)物的加工［14］。LIR1基因在鹽堿地星星草根中表達［10］，在400mmol/L NaHCO3脅迫6h后在星星草葉中上調表達［11］，在100mmol/L NaCl處理后在虎尾草中上調表達［12］。因此，LIR1基因可能在植物對鹽脅迫的適應性中發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)在NaCl脅迫晚期，星星草根中的PtLIR1基因響應鹽脅迫上調表達。由于類光誘導蛋白1基因可能與蔗糖水平的調節(jié)有關［15］，因此LIR1基因可能通過調節(jié)蔗糖水平參與植物對鹽脅迫的應答。在NaCl脅迫晚期，星星草根中的蔗糖積累至最高水平，PtLIR1基因的表達水平與蔗糖水平的變化趨勢一致，說明在鹽脅迫晚期PtLIR1基因可能是調節(jié)蔗糖水平的主要基因。鹽脅迫下PtLIR1基因可能通過調節(jié)蔗糖水平，以使蔗糖行使?jié)B透調節(jié)、保護分子結構，提供碳源和能量，以及通過信號傳導調節(jié)下游基因表達的功能從而響應鹽脅迫。植物LIR1基因的表達會受到可溶性糖的抑制［15，16］。植物在抵御寒冷脅迫的過程中往往伴隨著可溶性糖的積累，黑麥草類光誘導蛋白1基因LpLIR1在寒冷脅迫下先上調表達，然后下降到本底水平，表達水平的下降可能與可溶性糖的積累有關［15］。在NaCl脅迫早期，星星草根中的可溶性糖迅速積累響應鹽脅迫，星星草根中PtLIR1基因的表達水平與蔗糖和可溶性糖積累的水平均呈現(xiàn)出相反的變化趨勢。一方面提示我們，在鹽脅迫早期可溶性糖的積累可能對PtLIR1基因的表達產(chǎn)生了負調控；另一方面也說明，在NaCl脅迫早期蔗糖合成酶（sucrosesynthase，SS）、蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphatesynthase，SPS）和蔗糖轉化酶（invertase，Ivr）等其他蔗糖代謝相關酶基因可能在蔗糖水平的調節(jié)中發(fā)揮了更主要的作用。我們在前期的研究［13］和本研究中都發(fā)現(xiàn)了鹽堿地星星草根中PtLIR1基因的高水平表達，這提示PtLIR1基因的表達對星星草根適應鹽堿地逆境的重要性，以及蔗糖在此過程中可能執(zhí)行的重要功能。綜合文獻內容和我們的研究結果，將PtLIR1基因在星星草根逆境脅迫應答中的可能發(fā)揮的作用總結如圖7所示。為了深入了解PtLIR1基因在鹽脅迫應答中的作用，將通過進一步的研究明確PtLIR1基因是否通過調節(jié)蔗糖水平幫助星星草抵御鹽脅迫逆境，以及可溶性糖是否對PtLIR1基因具有負調控作用。

圖7 PtLIR1基因在星星草根逆境脅迫應答中的作用

4 結論

類光誘導蛋白1基因PtLIR1參與與星星草根對鹽脅迫的應答反應。在鹽脅迫早期，星星草根中PtLIR1基因的表達水平與可溶性糖水平的變化趨勢相反，可溶性糖的積累與PtLIR1基因的表達呈現(xiàn)出負相關性，但蔗糖卻迅速積累，其他蔗糖代謝相關基因可能在蔗糖水平的調節(jié)中發(fā)揮主要作用。在鹽脅迫晚期，星星草根中的PtLIR1基因響應鹽脅迫上調表達，蔗糖積累水平進一步上升，PtLIR1基因的表達水平與蔗糖水平的變化趨勢一致，在鹽脅迫晚期PtLIR1基因可能是參與調節(jié)蔗糖水平的主要基因。

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