劉 陽， 李軍亮， 許新科， 鄺崑琦， 翁胤侖， 陳 偉， 陳 程， 李方成，△

(1中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院神經(jīng)外科，2廣州市婦女兒童醫(yī)療中心神經(jīng)外科，廣東廣州 510120)

膠質(zhì)母細胞瘤是成人最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，惡性程度最高;具有高度異質(zhì)性和侵襲性，與正常組織分界不清，手術(shù)難以全部切除，同時對術(shù)后放、化療不敏感，易復發(fā)，預后極差，中位總體生存時間約為14.6月［1］。

谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidases，GPxs)是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，能夠有效清除代謝中產(chǎn)生的過多的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，減輕細胞氧化損傷，兩者在維持機體內(nèi)氧化-抗氧化平衡中發(fā)揮著重要的作用［2］。谷胱甘肽過氧化物酶1(glutathione peroxidase 1，GPx1)作為谷胱甘肽過氧化物酶族中最多見的抗氧化酶，能有效清除脂質(zhì)氫過氧化物和其它活性氧化物，在多個腫瘤中如乳腺癌、肺癌、前列腺癌均出現(xiàn)高表達，并能促進細胞的增殖、遷移和侵襲能力［3-5］。GPxs的異常高表達能清除某些腫瘤藥物誘導產(chǎn)生的 ROS 而出現(xiàn)耐藥［6］。研究［7-8］報道 GPx1在膠質(zhì)瘤中也同樣出現(xiàn)不同程度異常表達，并能影響膠質(zhì)瘤細胞氧化應激反應狀態(tài)。同時，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生可能與ROS引起細胞DNA損傷，導致遺傳信息的變異有關(guān)［9-10］。目前尚無GPx1影響膠質(zhì)瘤細胞增殖及侵襲能力方面的研究，我們推論通過針對GPx1誘導改變機體內(nèi)氧化還原反應狀態(tài)可能成為一種新治療腦膠質(zhì)瘤的輔助方法。故本研究通過合成小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和構(gòu)建、鑒定 pcDNA3.1-GPx1重組質(zhì)粒下調(diào)和上調(diào)GPx1，探討其對人膠質(zhì)母細胞瘤細胞株U87MG和U118MG的細胞活力、遷移和侵襲的影響，可為個體化誘導氧化還原反應狀態(tài)、輔助治療膠質(zhì)瘤提供新的實驗依據(jù)。

材料和方法

1 主要試劑

人膠質(zhì)母細胞瘤細胞株U87MG和U118MG購于ATCC;DMEM、MEM細胞培養(yǎng)液購自Gibco;胎牛血清購自BI;羊抗兔IgG II抗、細胞增殖檢測盒MTS和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自Sigma;兔抗人GPx1單克隆抗體購自CST;轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen;RIPA組織細胞裂解液購自碧云天公司;Matrigel膠購自BD;Transwell小室購自Costar;細胞RNA提取試劑盒、實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa。

2 siRNA的設(shè)計、合成和pcDNA3.1-GPx1重組質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定

選取特異性 GPx1序列正義鏈為5’-GGUACUACUUAUCGAGAAUTT-3’，反義鏈為 5’-AUUCUCGAUAAGUAGUACCTT-3’;陰性對照序列正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈為 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。將擴增克隆的GPx1基因片段按照產(chǎn)品說明與載體pcDNA3.1(Invitrogen)連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒?？寺⌒蛄薪?jīng)測序證實正確，可用于后續(xù)實驗。以上序列均由上海吉瑪制藥公司完成。

3 實驗方法

3.1 細胞培養(yǎng)、分組及 siRNA和 pcDNA3.1-GPx1的轉(zhuǎn)染 將U118MG細胞和U87MG細胞分別置于含10%小牛血清DMEM和MEM培養(yǎng)液中，于5%CO2、37℃濕度條件下培養(yǎng)。實驗分為空白對照(blank control，Ctr)組(加轉(zhuǎn)染試劑)、陰性對照(negative control，NTC)組(加入非特異性siRNA及轉(zhuǎn)染試劑、非特異性pcDNA3.1-GPx1及轉(zhuǎn)染試劑)、特異干擾組(加入GPx1-siRNA及轉(zhuǎn)染試劑、特異性pcDNA3.1-GPx1及轉(zhuǎn)染試劑)。取對數(shù)生長期細胞，用胰酶消化調(diào)節(jié)細胞濃度后接種于35 mm細胞培養(yǎng)皿中。待細胞生長至70% ～80%時，按照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作步驟分別對U87MG細胞和U118MG細胞進行siRNA和pcDNA3.1-GPx1轉(zhuǎn)染。繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h后換液，根據(jù)實驗需要收集細胞。

3.2 Real-time PCR檢測GPx1 mRNA的表達 提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用real-time PCR法。反應體系20 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應條件為:37℃ 15 min;85℃ 60 s。實驗重復3次，以β-actin為內(nèi)參照計算相對表達量(relative quantity，RQ)。GPx1引物序列正義鏈為 5’-AAGGTACTACTTATCGAGAATGTG-3’，反義鏈為 5’-GTCAGGCTCGATGTCAATGGTCTG-3’;β-actin引物序列正義鏈為5’-GGGTGTGGCACAGCTAGTTCCG-3’，反義鏈為 5’-CATTGTCAAGTGACGATCACAG-3’。

3.3 Western blotting檢測GPx1蛋白的表達 轉(zhuǎn)染后72 h，用PBS漂洗細胞3遍。收集細胞，用組織蛋白裂解液裂解細胞，置于冰上30 min，以12 000 r/min速率離心20 min。取上清20 μL，加入等體積的4×上樣緩沖液振蕩，煮沸10 min。用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定總蛋白濃度。定量后上樣，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，100 V電泳溴酚藍至凝膠底部。200 mA恒流2 h后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉液于常溫封閉1 h，TBST漂洗3次，加人兔抗人 GPx1單抗(1∶1 000)，孵育過夜，用TBST洗膜3次。加 II抗，于室溫孵育1 h。TBST洗膜，顯色。

3.4 MTS實驗檢測細胞活力 轉(zhuǎn)染后24 h細胞經(jīng)消化處理，配置為2×107/L濃度的細胞懸液，然后分別接種于96孔板，劑量為100 μL/孔，每組均設(shè)5個復孔。同時設(shè)置試劑組，不加任何細胞。觀察細胞完全貼壁后，分別于 24 h、48 h、72 h加入 20 μL MTS試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標儀于490 nm處測定吸光度值(A值)。按下列公式計算細胞活力抑制率(inhibitory rate，IR)=［對照組A值－實驗組A值］/對照組A值×100%;細胞活力促進率(promoting rate，PR)=［實驗組A值－對照組A值］/對照組A×100%。

3.5 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 將饑餓的細胞消化收集并計數(shù)，按每個小室5×104個細胞接種，上室中為含細胞的無血清的DMEM/MEM培養(yǎng)基，下室加入600 μL含10%血清的 DMEM/MEM培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)12 h，取出Transwell小室，用4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色，棉棒擦凈未穿透微孔濾膜的上室細胞，100倍倒置顯微鏡下隨機選擇5個視野，計數(shù)視野中的細胞數(shù)，以穿膜的細胞數(shù)表示細胞的遷移能力。制備無血清DMEN/MEM培養(yǎng)基與Matrigel膠1∶9比例稀釋的膠，每個小室鋪100 μL膠，4 h后吸出并將饑餓的細胞消化收集并計數(shù)，按每個小室1×105個細胞接種，上室中為含細胞的無血清的DMEM/MEM培養(yǎng)基，下室加入600 μL含20%血清的DMEM/MEM培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，后續(xù)操作同前，以穿膜的細胞數(shù)表示細胞的侵襲能力。按下列公式計算遷移抑制率(%)=(對照組遷移細胞數(shù)－實驗組遷移細胞數(shù))/對照組遷移細胞數(shù)×100%;遷移促進率(%)=(實驗組遷移細胞數(shù)－對照組遷移細胞數(shù))/對照組遷移細胞數(shù)×100%。侵襲計算方法同前。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析或t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 Real-time PCR檢測 U87MG、U118MG細胞GPx1 mRNA表達的情況

U87MG細胞的GPx1 mRNA表達量較內(nèi)參照β-actin的表達升高約7.60±3.21倍，說明U87MG細胞的GPx1 mRNA含量呈高表達(P＜0.05)。同時U118MG細胞GPx1 mRNA表達量較β-actin升高約1.26±0.50倍，但差異無統(tǒng)計學意義，說明經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后，U118MG細胞的GPx1 mRNA含量呈低表達，見圖1。

Figure 1.mRNA expression of GPx1 in U87MG cells and U118MG cells detected by real-time PCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs U118MG.圖1 Real-time PCR檢測U87MG和U118MG細胞GPx1 mRNA的表達情況

2 Western blotting檢測轉(zhuǎn)染后U87MG、U118MG細胞GPx1蛋白表達的情況

siRNA轉(zhuǎn)染72 h后U87MG細胞的GPx1蛋白表達明顯低于對照組及陰性對照組，說明經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后，U87MG細胞的GPx1蛋白含量明顯降低(P＜0.05)。同時pcDNA3.1-GPx1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72 h后U118MG細胞GPx1蛋白表達明顯高于對照組及陰性對照組，說明經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后，U118MG細胞的GPx1蛋白表達明顯升高(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.The protein expression of GPx1 in U87MG cells and U118MG cells interfered with the siRNA or pcDNA3.1 detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs blank control group(Ctrl)or negative control group(NTC).圖2 Western blotting檢測siRNA作用U87MG細胞和pcDNA3.1作用U118MG細胞后GPx1蛋白的表達情況

3 MTS實驗檢測細胞活力的變化

siRNA下調(diào)組24 h、48 h、72 h細胞活力抑制率分別為25.9%、35.7%、34.8%。siRNA組 U87MG細胞活力較空白對照組和陰性對照組明顯降低(P＜0.05)。質(zhì)粒上調(diào)組24 h、48 h、72 h細胞活力促進率分別為22.7%、45.8%、39.8%。質(zhì)粒組U118MG細胞的活性較空白對照組和陰性對照組明顯升高(P ＜0.05)，見表1～2。

表1 siRNA下調(diào)GPx1對U87MG細胞活力的影響Table 1.The effect of down-regulating the expression of GPx1 by the specific siRNA on the activity of U87MG cells(Mean±SD.n=3)

表2 質(zhì)粒上調(diào)GPx1對U118MG細胞活力的影響Table 2.The effect of up-regulating the expression of GPx1 by pcDNA3.1-GPx1 on the activity of U118MG cells(Mean±SD.n=3)

4 Transwell實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力

siRNA轉(zhuǎn)染后，U87MG細胞的遷移和侵襲能力明顯下降，各組穿膜細胞數(shù)與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，細胞遷移抑制率為41.6%±8.2%，細胞侵襲抑制率為40.4% ±10.1%;質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后U118MG細胞的遷移和侵襲能力顯著升高，各組穿膜細胞數(shù)與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，細胞遷移促進率為55.8% ±9.8%，細胞侵襲促進率為60.8% ±9.2%，見圖3、4及表3、4。

Figure 3.The effect of down-regulating the expression of GPx1 by the specific siRNA on the migration and invasion of U87MG cells(×40).圖3 siRNA下調(diào)GPx1基因?qū)87MG細胞的遷移與侵襲能力的影響

Figure 4.The effect of up-regulating the expression of GPx1 by pcDNA3.1-GPx1 on the migration and invasion of U118MG cells(×40).圖4 質(zhì)粒上調(diào)GPx1基因?qū)118MG細胞的遷移與侵襲能力的影響

表3 siRNA下調(diào)GPx1對U87MG細胞遷移與侵襲能力的影響Table 3.The effect of down-regulating the expression of GPx1 by the specific siRNA on migration and invasion of U87MG cells(Mean±SD.n=3)

表4 質(zhì)粒上調(diào)GPx1對U118MG細胞遷移與侵襲能力的影響Table 4.The effect of up-regulating the expression of GPx1 by the pcDNA3.1－GPx1 on migration and invasion of U118MG cells(Mean±SD.n=3)

討 論

膠質(zhì)母細胞瘤的治療仍以手術(shù)切除為主，同期放化療或其它治療為輔，但因其高度侵襲性和異質(zhì)性決定任何單一的治療方法都有一定的局限性，探索新的治療方法迫在眉睫［11］。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比上調(diào)GPx1表達后U118MG細胞的活力、遷移和侵襲能力均有促進作用;相反的，下調(diào) GPx1的表達后U87MG細胞的活力、遷移和侵襲均有抑制作用。由上述結(jié)果可以看出GPx1的表達狀態(tài)對膠質(zhì)母細胞瘤細胞的活力、遷移和侵襲能力有著明顯的調(diào)控作用，具體機制仍然不清楚。生理情況下，機體內(nèi)的自由基能夠通過濃度改變引起細胞氧化應激反應誘導細胞凋亡、壞死的功能，調(diào)節(jié)著機體細胞的生死平衡［12-13］。研究發(fā)現(xiàn)GPxs、ROS的異常表達常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密不可分的關(guān)系［2-3，10］。Szatrowski等［14］研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞較正常細胞產(chǎn)生更多的活性氧化物或其中間產(chǎn)物，以致腫瘤變異，損傷局部正常組織，向周圍組織侵襲，發(fā)生轉(zhuǎn)移?？赡苁歉弑磉_的GPx1過多清除活性氧簇，降低了ROS對本就比正常細胞耐受的高應激狀態(tài)的腫瘤細胞的殺傷效應，同樣有研究指出低濃度的ROS能夠激活轉(zhuǎn)錄因子以及促進腫瘤細胞增殖和分化［13］。膠質(zhì)瘤的侵襲是一個多步驟的復雜過程，包括腫瘤細胞黏附，細胞外基質(zhì)降解及細胞移動等，細胞外基質(zhì)的降解是關(guān)鍵。基質(zhì)金屬蛋白酶2和尿激活型纖溶酶原在惡性膠質(zhì)瘤中表達，均介導細胞周圍基質(zhì)蛋白的降解，均與膠質(zhì)瘤的侵襲性和血管生成有密切關(guān)系［15-16］。研究發(fā)現(xiàn)高表達GPx1的腫瘤細胞中伴有基質(zhì)金屬蛋白酶2和尿激酶型纖溶酶原激活因子蛋白的表達升高［4］。推測其可能通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶2和尿激酶型纖溶酶原激活因子通路促進細胞遷移和侵襲。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA組細胞遷移抑制率為40% ～50%，細胞侵襲抑制率為40% ～50%;質(zhì)粒上調(diào)組細胞遷移促進率為50% ～60%，細胞侵襲抑制率為50%～70%。可見GPx1的表達對膠質(zhì)母細胞瘤的遷移和侵襲能力影響顯著。siRNA下調(diào)GPx1后對24 h、48 h、72 h細胞生長抑制率為25% ～35%，同時質(zhì)粒上調(diào)組24 h、48 h、72 h細胞增殖促進率20% ～40%。相較而言，下調(diào)GPx1抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖效果不理想，考慮可能因為膠質(zhì)母細胞瘤細胞高氧化應激耐受。也可能因為硫氧化還原蛋白還原酶在惡性腫瘤細胞中高表達，對腫瘤的生長有著重要的作用［10］。望能夠通過后續(xù)研究驗明作用機制后可以提高其有效性。

綜上，本研究結(jié)果表明通過小干擾RNA成功下調(diào)GPx1表達，能夠抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的生長，并顯著抑制細胞遷移和侵襲能力，對臨床上抑制膠質(zhì)母細胞瘤的生長，特別是腫瘤轉(zhuǎn)移的治療有著重要的意義。

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