朱光旭， 周 芳， 阮光萍， 宋明寶， 楊建勇， 黃 嵐， 康華莉， 潘興華

動脈粥樣硬化等損傷性血管疾病病理變化主要表現(xiàn)為內皮再生延遲以及血管傷處平滑肌細胞(smooth muscle cells，SMCs)過度增生，導致新生內膜形成。大量研究證實內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)參與血管損傷修復［1-2］，可以有效抑制新生內膜增生［2-4］。細胞間相互作用是細胞生命活動重要調節(jié)方式之一。EPCs歸巢到血管損傷部位后，細胞間的影響主要來自血管損傷邊緣的內皮細胞(endothelial cells，ECs)、再生內皮或 SMCs，因此推測EPCs與SMCs間相互作用可能在EPCs修復損傷血管內膜過程中起重要調節(jié)作用。我們前期研究表明，EPCs生物學活性具有年齡相關性特點，年輕大鼠來源EPCs較老齡大鼠來源者具有更好的增殖、遷移和分化能力［5-6］。本研究通過建立細胞共培養(yǎng)體系，觀察老齡和年輕個體來源EPCs對SMCs表型和增殖遷移活性的影響，旨在揭示不同年齡個體來源EPCs移植修復損傷血管過程中對SMCs可能的調節(jié)作用。

材料和方法

1 主要材料

1～2月齡、19～26月齡的SD大鼠，雌雄不限，無既往病史，環(huán)境濕度、溫度適中，飲食良好，由第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院實驗動物中心提供。所有動物實驗經(jīng)第三軍醫(yī)大學及成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院倫理委員會批準。DMEM/F12干粉培養(yǎng)基(HyClone);內皮細胞生長添加劑(endothelial cell growth supplements，ECGs)購于BD;優(yōu)質胎牛血清(PAA);DiI標記乙酰化低密度脂蛋白(DiI-labeled acetylated low-density lipoprotein，DiI-Ac-LDL)購于 Molecular Probe;FITC標記荊豆凝集素I(FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin I，F(xiàn)ITC-UEA-I)購于 Vector;Ficoll液(Amersham);大鼠血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)購于 Sigma;小鼠抗大鼠血管內皮細胞生長因子受體2(Flk-1/VEGFR2/KDR)、兔抗大鼠 CD133(BioSource);山羊抗大鼠CD34(Novus);山羊抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、抗大鼠steopontin抗體(Santa Cruz);小鼠抗大鼠 α-SM-actin抗體 (Sigma);［3H］-胸腺嘧啶脫氧核苷(［3H］-TdR)(上海原子核研究所);Transwell培養(yǎng)板(Corning);倒置熒光相差顯微鏡 (Leica);液體閃爍計數(shù)器(Beckmen)。

2 方法

2.1 EPCs的培養(yǎng)及鑒定 脫臼處死SD大鼠，無菌取出股骨和脛骨，PBS沖洗骨髓，F(xiàn)icoll液密度梯度離心 (2 000 r/min，30 min)分離單個核細胞(mononuclear cells，MNCs)，PBS洗滌后，差速貼壁法進行培養(yǎng)［6］。2次貼壁細胞培養(yǎng)14 d后，DiI-Ac-LDL(10 mg/L)及FITC-UEA-I(10 mg/L)避光孵育，置熒光顯微鏡下觀察。在貼壁細胞長至約50%融合時收集培養(yǎng)細胞進行流式分析，步驟如下:收集細胞加入2 mL圓底離心管中，PBS洗3次，每次1 min，4℃、1 500 r/min離心5 min，棄上清;用 PBA(含1%牛血清白蛋白及0.1%疊氮鈉)稀釋 I抗，與細胞混勻，4℃或置冰上孵育1.5 h，離心棄上清;冷PBS 1 mL離心洗滌1次，以去除多余的未結合的特異性抗體;加入PBA稀釋的FITC標記山羊抗小鼠IgG抗體、PE標記驢抗山羊IgG或TRITC標記雞抗兔IgG II抗(1∶200)200 μL，吹打混勻，4 ℃或置冰上避光孵育45 min，再用冷PBS 1 mL離心洗滌2次，每次1 min;將細胞重新懸浮于500 μL PBS中，避光混勻，以同型抗體作為對照置流式管上機檢測。

2.2 SMCs培養(yǎng)及鑒定 參照文獻采用組織塊法培養(yǎng)SMCs［7］，具體操作過程如下:頸椎脫臼處死大鼠，無菌取大鼠胸腹主動脈，仔細清除血管外膜及脂肪組織，將血管縱向剖開，用0.01 mol/L PBS漂洗干凈，用眼科鑷刮去血管內膜，放入50 mL培養(yǎng)瓶中，在瓶口用眼科剪剪成約1.5 mm ×1.5 mm×1.5 mm大小的組織塊，用吸管將組織塊隨機鋪于瓶底，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，將貼有貼塊的培養(yǎng)瓶反轉放置使貼塊位于頂側，培養(yǎng)4 h后，加入含20%FBS和雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，恢復正常放置繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液1次，培養(yǎng)細胞用α-SM-actin進行平滑肌表型鑒定。

2.3 貼壁細胞數(shù)目與增殖能力檢測 細胞首次貼壁培養(yǎng)24 h，棄早期貼壁細胞，離心收集懸浮細胞，以15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基(含內皮細胞生長添加劑100 mg/L，肝素100 mg/L，青、鏈霉素各1×105U/L)、同等體積培養(yǎng)基以及相同細胞數(shù)接種于纖維連接蛋白包被24孔板，4 d后棄懸浮細胞，顯微鏡(×400)下計數(shù)每個視野下貼壁細胞數(shù)。首次貼壁后收集懸浮細胞，離心棄上清，以新鮮培養(yǎng)基分別配成濃度梯度細胞懸液，接種于纖維連接蛋白包被96孔板，4 d后棄懸浮細胞，鏡下觀察每孔貼壁細胞密度，在老年和年輕組分別選擇貼壁細胞密度大致相等的6孔，加入新培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待生長速度最快的孔內EPCs鋪滿孔底約90%后，用MTT法檢測細胞增殖，每孔加入 MTT(5 g/L)20 μL，37 °C 繼續(xù)孵育4 h，棄上清，各孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，室溫振蕩 10 min，HT-7000 Plus多孔讀數(shù)儀492 nm讀取吸光度值，以培養(yǎng)液孔作為空白調零。

2.4 實驗分組 實驗分為 (1)P3組:第3代(P3)SMCs;(2)P4組:將 P3 SMCs以低濃度(2×106cells/L，3 mL/well接種)傳代(P4)培養(yǎng)于6孔板內，但是上室不接種 EPCs，僅加入等量培養(yǎng)基;(3)P4YE組:上室為融合生長的年輕(young，Y)大鼠來源EPCs，下室為P4 SMCs;(4)P4AE組:上室為融合生長的老齡(aged，A)大鼠來源 EPCs，下室為 P4 SMCs。

2.5 細胞共培養(yǎng)體系建立 將骨髓單個核細胞直接接種于Transwell insert膜(膜孔徑0.4 μm)上，按照我們前期方法進行EPCs培養(yǎng)［6］，EPCs生長至融合后換無血清培養(yǎng)基，取P3 SMCs，將其以2×106cells/L，3 mL/well接種于6孔板內，細胞貼壁后換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后將Transwell insert插入種有SMCs的6孔板中，使下室為SMCs，上室為EPCs，換含5%FBS的DMEM/F12(含內皮細胞生長添加劑100 mg/L，肝素100 mg/L，青、鏈霉素各1×105U/L)進行培養(yǎng)，兩室培養(yǎng)基通過Transwell insert膜交通，從而建立Transwell共培養(yǎng)體系，每3 d換液1次，共培養(yǎng)4 d后進行表型標志蛋白檢測。

2.6 Western blotting檢測 α-SM-actin及 osteopontin的表達 用4℃預冷的PBS洗細胞3次，加入預制的含PMSF的裂解液，冰上裂解30 min，裂解后，將細胞碎片和裂解液移至離心管。4℃、16 000 r/min離心20 min，收集上清，取其中少量測蛋白濃度(BCA法)。取等量預處理的蛋白樣品上樣，恒壓81 V進行SDS-PAGE，電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉-PBST室溫封閉 1 h后，加入抗大鼠 α-SM-actin抗體(1∶800)、GAPDH 或 osteopontin(1∶600)，4 ℃孵育過夜，再與HRP標記的兔抗羊IgG、抗鼠IgG 37℃孵育1 h，化學發(fā)光顯色后用凝膠成像系統(tǒng)掃描，半定量分析顯影帶，目的蛋白量以GAPDH相對量表示。

2.7 ［3H］-TdR摻入法檢測SMCs增殖 將 P4 SMCs以3×107cells/L、3 mL/well接種于6孔板內，細胞貼壁后換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，然后將種有EPCs的Transwell insert插入6孔板中，共培養(yǎng)48 h后終止培養(yǎng)。參照文獻［8］，終止培養(yǎng)前于共培養(yǎng)體系(膜孔徑0.4 μm)中加入［3H］-TdR，使其終濃度為3.7×104kBq/L，繼續(xù)共同培養(yǎng)24 h后用多頭細胞收集器收集細胞于玻璃纖維濾膜上，用10% 三氯醋酸處理、洗凈，濾膜經(jīng)紅外線烤箱烘烤后置入閃爍瓶，加脂溶性閃爍液，在Beckmen β液體閃爍記數(shù)器上測定，結果以每分鐘計數(shù)(counts per mimute，CPM)/well表示，摻入量反映SMCs DNA合成速率。2.8 細胞劃痕實驗 參照文獻［9］，將 SMCs接種到6孔板內，以含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)待培養(yǎng)SMCs達到完全融合生長后，用200 μL移液管經(jīng)過板孔中心、比著直尺垂直于板底無菌低速劃痕，用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，插入培養(yǎng)有融合生長狀態(tài) EPCs的 Transwell insert膜，使上室為EPCs，下室為劃痕 SMCs，換含20%FBS的 DMEM/F12(含內皮細胞生長添加劑100 mg/L，肝素100 mg/L，青、鏈霉素各 1 ×105U/L)進行培養(yǎng)，于 0、6、12、24 h觀察拍照，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(Media Cybernetics)進行圖像分析。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，以SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 培養(yǎng)細胞的生長特征及鑒定

1.1 EPCs的培養(yǎng)及鑒定 2次貼壁培養(yǎng)的骨髓EPCs大多呈梭形或卵圓形，在貼壁細胞數(shù)量上，2次貼壁培養(yǎng)4 d，年輕組來源的骨髓MNCs貼壁細胞數(shù)量顯著高于老齡組;同等培養(yǎng)條件下年輕個體來源細胞的增殖活性也顯著高于老年組(P＜0.05)。細胞貼壁后第3天可見明顯索狀生長結構;EPCs培養(yǎng)到第14天，老年和年輕組細胞均逐漸趨于呈融合生長狀態(tài);培養(yǎng)12 d后，年輕和老齡組DiI-Ac-LDL及FITC-UEA-I雙染，隨機挑選6個視野計數(shù)雙染陽性細胞百分率，分別為(92.70±3.45)%與(81.40±7.82)%，表明培養(yǎng)骨髓MNCs具有成熟內皮細胞特征。流式細胞分析表明培養(yǎng)細胞表達CD34、CD133以及Flk-1，年輕組表達顯著高于老齡組(P＜0.01)，見圖1。

Figure 1.Characteristics of bone marrow derived endothelial progenitor cells(EPCs).A:secondary attached cells，the arrow shows the net-work of EPCs;B:EPCs cultured after 14 d AC:DiI-Ac-LDL positive cells;D:FITC-UEA-I positive cells;E:cell number of secondary attached cells;F:histogram analysis of EPCs proliferation;G:FACS analysis of CD34，CD133 and VEGFR2 expression in cultured MNCs after 14 d of culture.Mean±SD.n=4.＊＊P ＜0.01 vs aged group.圖1 培養(yǎng)骨髓EPCs的生長特征

1.2 SMCs培養(yǎng)及鑒定 培養(yǎng)5 d左右可見長梭型細胞自組織塊邊緣長出(圖2A)，14 d左右可見培養(yǎng)細胞呈“谷峰”樣生長(圖2B)，取傳代培養(yǎng)細胞進行α-SM-actin染色呈陽性，對照為陰性，證實所培養(yǎng)的細胞為SMCs(圖2C)。

Figure 2.SMCs culture and identification.A:5 d later，several cells were found around the cultured tissue blocks;B:after 14 d cultured，the cell showed a valley like growth state;C:immunostaining suggested that the cultured cells were expressed α-SM-actin.圖2 培養(yǎng)SMCs的生長特征

2 共培養(yǎng) EPCs及 SMCs后 SMCs α-SM-actin及osteopontin的表達

α-SM-actin是收縮型 SMCs主要標志之一［10］。與P3組相比，傳代培養(yǎng)(P4)可使SMCs的α-SM-actin表達減少，但是與P4YE SMCs的α-SM-actin表達無顯著差別，表明年輕大鼠來源的EPCs可以延遲SMCs表型轉換。與P4YE組比較，共培養(yǎng)老年個體來源EPCs延遲效應顯著減弱，但是該組SMCs的α-SM-actin表達與P3組比較仍顯著高于 P4組，見圖3。

Figure 3.The effect of co-culture EPCs and donor age on theprotein expression of α-SM-actin in the SMCs.Mean±SD.n=4.＊＊P ＜0.01 vs P3 group;#P ＜0.05，##P＜0.01 vs P4 group;▽P＜0.05 vs P4YE group.圖3 共培養(yǎng)EPCs與SMCs后SMCs α-SM-actin蛋白的表達

Osteopontin是合成型 SMCs的主要標志［9］。與P3組相比，SMCs傳代培養(yǎng)可使SMCs(P4)內的osteopontin增強(P＜0.01);而共培養(yǎng)年輕大鼠來源EPCs組(P4YE)SMCs的osteopontin表達與P3組比較未見有顯著差別;與P4YE組比較，老齡個體來源的EPCs抑制osteopontin的表達能力顯著減弱，但是其表達仍顯著低于P4組(P＜0.05)，見圖4。

Figure 4.The effect of co-culture EPCs and donor age on theprotein expression of osteopontin in the SMCs.Mean±SD.n=4.＊＊P ＜0.01 vs P3 group;#P ＜0.05，#P＜0.01 vs P4 group;▽P＜0.05 vs P4YE group.圖4 共培養(yǎng)EPCs與SMCs后SMCs osteopontin蛋白的表達

3 共培養(yǎng)EPCs對SMCs的增殖的影響

共培養(yǎng)EPCs顯著抑制SMCs的增殖。與P4組相比，P4YE組與P4AE組［3H］-TdR摻入量均顯著降低(P＜0.05)，P4YE組與P4AE組的摻入量也有顯著差別(P＜0.05)，見圖5。

Figure 5.The effect of donor age and co-culture EPCs on the proliferation of SMCs.Mean±SD.n=6.#P＜0.05，##P＜0.01 vs P4 group;▽P＜0.05 vs P4YE group.圖5 共培養(yǎng)EPCs對SMCs的增殖能力的影響

4 共培養(yǎng)EPCs對SMCs的遷移的影響

供體年齡對共培養(yǎng)融合生長EPCs條件下SMCs遷移能力的影響見圖6。細胞培養(yǎng)12 h后，與P4組相比，P4YE余留面積顯著增加(P＜0.01)，P4AE組也比P4組顯著增加(P＜0.05)，但顯著低于P4YE組(P＜0.05)，表明年輕大鼠來源的融合生長EPCs可以顯著抑制SMCs遷移，EPCs供體衰老削弱融合生長EPCs對SMCs遷移的抑制能力。

討 論

EPCs也稱內皮前體細胞，可分化為成熟的ECs，參與損傷血管再內皮化及血管重建，且抑制新生內膜增生［2-3］。骨髓是EPCs主要來源之一，在缺血組織血管新生及血管內膜損傷時可動員入血，歸巢到血管損傷部位，參與損傷血管內膜修復。盡管已有大量關于EPCs表型特征以及臨床應用的研究，但是迄今尚未有公認的標準培養(yǎng)方法以及統(tǒng)一的定義，比較明確的是，EPCs既具有干細胞特性，又具有ECs的部分特征，可以誘導分化為成熟ECs。ECs具有吞噬Ac-LDL功能，同時有具有結合UEA-I特性，目前已有較多文獻研究以DiI-Ac-LDL以及FITC-UEA-I雙染陽性作為鑒定EPCs的重要指標之一［11-12］;在干細胞標志方面EPCs主要表達CD34、CD133等［13-14］。本次實驗選擇2次貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)EPCs，文獻報道該方法可有效減少包括成熟ECs在內的其它類別單個核細胞影響［11］。實驗結果顯示培養(yǎng)的骨髓MNCs DiI-Ac-LDL與FITC-UEA-I雙染陽性，流式細胞分析也表明培養(yǎng)細胞表達VEGFR2、CD34和CD133，證實此次實驗培養(yǎng)的骨髓MNCs具有EPCs生物學特征。此外，在EPCs增殖速度以及表面標志表達方面，實驗結果也進一步證實不同年齡個體來源EPCs活性具有年齡相關性特點。

Figure 6.The effect of donor age and co-culture EPCs on the migration ability of SMCs.The cell migration ability was examined by scratch wound healing assay under a microscope.Mean ± SD.n=5.Scale bar=100 μm.#P＜0.05，##P＜0.01 vs P4 group;▽P＜0.05 vs P4YE group.圖6 共培養(yǎng)EPC對SMCs的遷移能力的影響

EPCs歸巢到血管損傷部位修復損傷血管過程中，主要受到來自血管損傷邊緣的ECs、再生內皮或損傷處暴露的SMCs的調節(jié)作用。EPCs與SMCs自身均可以表達多種蛋白或者分泌細胞因子，相互影響這兩種細胞的生物學行為，可能極大地影響其修復損傷血管進程，已有研究發(fā)現(xiàn)ECs調節(jié)了SMCs的增生和遷移［15］。盡管有大量文獻報道EPCs促進損傷血管內皮再生［1-2］以及抑制新生內膜增生［2-4］，然而迄今未見有關于EPCs與SMCs間相互影響的文獻報道。文獻研究以及本次實驗均表明EPCs生物學活性具有年齡相關性特點，年輕大鼠來源EPCs較老齡大鼠來源者具有更好的增殖、遷移和分化能力［5-6，12］，因此 EPCs 供體年齡也可能調節(jié) EPCs 與SMCs間相互作用，進而影響EPCs修復損傷血管內膜進程。

血管在胚胎發(fā)生期來自中胚層，在以后的發(fā)育過程中，逐漸分化為不同的細胞群，并獲得具有成年特征的分化表型。根據(jù)結構和功能的不同，VSMCs可分為收縮型(分化型)和合成型(未分化型或去分化型)2種表型，SMCs由收縮型向合成型轉換是其開始增生的先決條件［16］。正常時血管SMCs為收縮型，各種因素導致血管損傷后，暴露的血管SMCs由收縮型向合成型轉變，隨即開始增生、遷移形成新生內膜。α-SM-actin是收縮型血管SMCs主要標志之一［10］，在合成型中表達甚微［16］，而 osteopontin 是合成型SMCs的重要標志，在收縮型中幾乎不表達［9］。在離體培養(yǎng)SMCs過程中，隨著細胞傳代，SMCs表型也迅速由主要是收縮型向合成型轉變［17］。本次實驗結果表明，在P3與P4 SMCs中，α-SM-actin表達顯著下調，而osteopontin表達則顯著上調。共培養(yǎng)研究結果顯示融合生長狀態(tài)的EPCs可以顯著抑制傳代培養(yǎng)SMCs的α-SM-actin表達下調，同時也阻抑osteopontin表達上調，表明融合生長狀態(tài)的EPCs可以延緩SMCs由收縮型向合成型轉變，提示在損傷血管過程中EPCs抑制損傷血管SMCs表型轉換可能是重要調節(jié)機制之一。實驗也觀察到老齡個體來源EPCs延緩SMCs表型轉換的能力較年輕個體來源EPCs顯著減弱，進一步說明年輕個體來源EPCs較老齡個體來源者有更好的修復損傷血管能力。有關EPCs延遲SMCs表型轉換文獻研究極其少見，機制尚不明確。新近研究報道內皮Jagged1表達在血管損傷后新生內膜SMCs增生調控中有重要作用，Jagged1在老齡個體血管ECs較年輕個體來源ECs表達顯著減弱，ECs過表達Jagged1可顯著抑制SMCs過度增生，下調ECs Jagged1表達促進血小板源性生長因子誘導的SMCs增殖和遷移［18］。我們在前期實驗中也觀察到Jagged1也表達于EPCs，并且發(fā)現(xiàn)Jagged1在年輕個體來源EPCs表達較老齡個體顯著增強，EPCs抑制SMCs表型轉換過程中是否通過Jagged1相關信號轉導系統(tǒng)發(fā)揮作用尚需深入研究。由于血管SMCs由收縮型向合成型轉換是其開始增生和遷移的先決條件，SMCs表型轉變從一側面反映了其增殖和遷移能力的變化，共培養(yǎng)EPCs顯著抑制SMCs增殖和遷移能力，老齡個體來源 EPCs抑制SMCs增殖和遷移能力較年輕個體來源EPCs顯著減弱，提示供體年齡在融合生長狀態(tài)EPCs抑制血管SMCs表型轉換及增殖和遷移中有重要調節(jié)作用。

細胞間相互調節(jié)是一極復雜的病理生理活動［19-20］，細胞生長狀態(tài)與其本身具有的調節(jié)功能密切相關。文獻報道ECs不同生長狀態(tài)對SMCs具有不同的調節(jié)作用，融合生長狀態(tài)ECs促進SMCs表達α-SM-actin，而對數(shù)生長期 ECs 則抑制其表達［21］。此外ECs和SMCs間相互作用不僅調節(jié)了SMCs生物學特性，而且對ECs本身也具有調節(jié)作用。新近研究報道ECs與SMCs之間通過連接蛋白Cx43和Cx47進行相互調節(jié)，并且證實ECs與SMCs之間相互作用調節(jié)了ECs的表型［22］。本次研究結果揭示EPCs調節(jié)SMCs表型轉換和增殖遷移具有年齡相關性，為EPCs臨床應用提供了部分實驗依據(jù)，然而本次實驗共培養(yǎng)體系中使用融合生長狀態(tài)EPCs，對于其它生長狀態(tài)、細胞數(shù)量、接觸方式等對SMCs有何不同調節(jié)作用尚未明確，EPCs本身具有干、祖細胞特性，SMCs表型變化、生長狀態(tài)也極可能影響EPCs分化及功能，反過來又可能影響EPCs對SMCs的調節(jié)，因此對于闡明EPCs與SMCs間相互調節(jié)作用及詳細機制，尚需大量深入的研究。

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