王 青， 羅彥彰， 林修賢， 榮冬秀， 張 濤， 王 通， 崔毅峙

細(xì)胞體外培養(yǎng)模型是病理生理研究中不可或缺的工具，然而，實(shí)驗(yàn)室支原體污染在世界范圍內(nèi)廣泛流行，其在體外組織培養(yǎng)的污染率高達(dá)5% ～35%［1-2］。支原體是已知最小的原核生物，直徑多為0.1 ～0.3 μm，能夠通過除菌濾膜(0.22 μm)，其唯一可見的細(xì)胞器是核糖體。受非致病性支原體污染的細(xì)胞株往往沒有明顯的形態(tài)或培養(yǎng)基變化［3］，因而常被忽視。但是，科研界公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)是，以有支原體污染的組織培養(yǎng)模型得到的科學(xué)結(jié)論被認(rèn)為是假象。

我們在以往的工作中成功建立了真核細(xì)胞翻譯組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究平臺，并利用該策略闡明了在穩(wěn)態(tài)腫瘤細(xì)胞中存在長度依賴的翻譯偏好現(xiàn)象，以及闡述了這種偏好與腫瘤細(xì)胞的表型密切相關(guān)［4］。該策略的技術(shù)內(nèi)核是人細(xì)胞的核糖體新生肽鏈復(fù)合物(ribosome nascent-chain complex，RNC)的分離和提取，從而研究RNC結(jié)合的翻譯中mRNA(RNC-mRNA)的組學(xué)規(guī)律。RNC中包含的是已裝配完畢的成熟核糖體。

Levine等［5］曾報(bào)道支原體感染會引起總RNA組分中的核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA)相對含量的改變。我們實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)支原體污染的細(xì)胞總RNA組分改變并不顯著，然而成熟核糖體中RNC-rRNA的變化尚未見報(bào)道。由于支原體富含核糖體且具改變細(xì)胞表型能力，我們假設(shè)支原體污染會引起宿主細(xì)胞的RNC-rRNA組成發(fā)生改變?；卮鹪搯栴}不但可在翻譯層面闡述支原體輸入對人細(xì)胞的影響，同時(shí)可探索RNC-rRNA作為支原體污染檢測的可行性;進(jìn)而，也有望為評價(jià)支原體污染臨床治療的療效提供一條新途徑。因此，本研究利用RNC分離技術(shù)從人類細(xì)胞株中分離得到成熟的核糖體，并研究實(shí)驗(yàn)室支原體污染對RNC-rRNA組成的改變，并初步探索了絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途徑在該過程中的可能作用。

材料和方法

1 材料

1.1 主要材料 HBE、H1299和 A549細(xì)胞購自ATCC;Hep3B、HCCLM3、HCCLM6 細(xì)胞來自復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院;超速離心機(jī)及SW60 Ti轉(zhuǎn)子購自Beckman;瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)購自北京市六一儀器廠;SDS-PAGE及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購自Bio-Rad，PVDF膜購自Millipore。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco，瓊脂糖購自 Invitrogen;KCl、MgCl2、HEPES、KOH 和蔗糖購自天津市大茂化學(xué)試劑廠;放線菌酮(cycloheximide，CHX)和SDS裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;DTT購自廣州捷倍斯生物科技有限公司;Triton X-100購自Sigma;支原體檢測試劑盒購自上海依科賽生物制品有限公司;ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK 和p-JNK抗體購自CST，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體和Ⅱ抗購自Bioworld。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HBE、A549、H1299、Hep3B、HCCLM3和HCCLM6細(xì)胞按照我們已發(fā)表的方法進(jìn)行培養(yǎng)［4，6］。

2.2 支原體污染的治療 根據(jù)文獻(xiàn)［7］方法，在被支原體污染的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入環(huán)丙沙星，終濃度為10 mg/L，連續(xù)傳代培養(yǎng)7代后進(jìn)行再次檢驗(yàn)。

2.3 支原體的PCR檢測 依照支原體檢測試劑盒說明書進(jìn)行PCR檢測。用無抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長至80%以上。取1 mL細(xì)胞培養(yǎng)上清，放入離心管中。13 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS洗沉淀1次。加入100 μL裂解液裂解細(xì)胞，上下顛倒混勻后，室溫放置5 min。細(xì)胞裂解液95℃處理5 min。13 000 r/min離心5 min，上清轉(zhuǎn)入新離心管。取2 μL上清作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng):95℃ 30 s;95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。

2.4 真核細(xì)胞RNC提取 依照我們發(fā)表的方法提取真核細(xì)胞RNC［4］。細(xì)胞在T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2 d后，在培養(yǎng)基中加入CHX，至終濃度100 mg/L，放入培養(yǎng)箱中孵育15 min。將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至冰上，棄去上清，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌2次。在瓶中加入500 μL裂解液(20 mmol/L HEPES-KOH，15 mmol/L MgCl2，200 mmol/L KCl，100 mg/L CHX，2 mmol/L DTT和1%Triton X-100，置于冰上裂解30 min。刮下細(xì)胞，收集裂解液，16 200 ×g，4℃離心10 min。在超速離心管中加入30%蔗糖溶液2 mL，沿管壁緩慢加入細(xì)胞裂解液500 μL(蔗糖與裂解液比例不得小于3∶1)。185 000 ×g，4 °C 離心3 h，棄上清，用100 μL Buffer RB(20 mmol/L HEPES-KOH，15 mmol/L MgCl2，200 mmol/L KCl，100 mg/L CHX，2 mmol/L DTT)重懸沉淀，并轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的EP管中。2.5 RNC-RNA提取 用TRIzol Reagent提取RNCRNA。在2.4中得到的RNC中加入1 mL TRIzol Reagent，充分混勻后室溫靜置3 min。加入200 μL氯仿，渦旋混勻15 s，室溫靜置5 min。12 000×g，4℃離心15 min，溶液分為3層，小心吸取水相層，轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入1倍體積的異丙醇，混勻后－20℃靜置過夜。12 000 ×g，4℃離心30 min，用－20℃預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀物2次，風(fēng)干乙醇后加入 30 μL RNase-free H2O。

2.6 瓊脂糖凝膠電泳 以標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNC-RNA，凝膠濃度為2%，每孔上樣量為1 μg，90 V電泳約1 h。用 SYBR-Green II染色后用290 nm紫外光激發(fā)照相獲取RNC-RNA條帶圖譜。2.7 Western blot 細(xì)胞樣品用SDS裂解液裂解提取總蛋白，10%SDS-PAGE分離蛋白，濃縮膠中60 V電泳30 min，分離膠中80 V電泳2 h。取出凝膠，以230 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h。5% 脫脂牛奶封閉1 h，Ⅰ抗以1∶1 000稀釋，4℃過夜，Ⅱ抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育1 h，顯影。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

瓊脂糖凝膠電泳圖在ImageJ軟件中測定各泳道內(nèi)各截面的總灰度值［8］;數(shù)據(jù)以Matlab R2013a軟件分析并作圖。Western blot實(shí)驗(yàn)中，用ImageJ軟件測量蛋白條帶灰度值。以GAPDH條帶灰度值對目的條帶灰度值歸一化，使用GraphPad Prism 6.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。我們采用雙尾配對t檢驗(yàn)以排除不同膠片曝光參數(shù)不同帶來的誤差。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 支原體污染對H1299和A549細(xì)胞的RNC-rRNA組成影響

我們以PCR方法分別對本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的2株肺來源癌細(xì)胞株H1299和A549進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示該H1299細(xì)胞呈支原體陰性(表現(xiàn)為280 bp條帶陰性，150 bp條帶陽性)，而A549細(xì)胞受支原體污染(280 bp和150 bp條帶雙陽性)。我們分別提取了這2株細(xì)胞的RNC并從中分離出RNC-RNA，瓊脂糖凝膠電泳圖顯示，支原體陰性細(xì)胞株H1299具有清晰的28S(～4 700 nt)和18S(～1 900 nt)條帶，為典型真核生物rRNA帶型;相反，A549細(xì)胞RNC-rRNA帶型發(fā)生明顯改變，28S條帶灰度值明顯下降，同時(shí)在約1 540 nt處出現(xiàn)典型的原核生物16S rRNA特征性條帶，此外在約700 bp處出現(xiàn)1條來源不明的條帶，以下稱Unknown條帶?；叶确治霰砻?，支原體陽性細(xì)胞RNC-RNA中28S和18S rRNA條帶所占比例大幅減少，相反16S rRNA和Unknown條帶所占比例明顯上升，見圖1。

Figure 1.Decreases in 28S and 18S rRNA in the RNC-RNA fraction of mycoplasma-contaminated human H1299 and A549 cells.圖1 支原體污染降低人肺癌H1299和A549細(xì)胞株RNC-RNA中的28S和18S rRNA

2 RNC-rRNA組成變化的獲得性實(shí)驗(yàn)

我們進(jìn)而利用本實(shí)驗(yàn)室專用于培養(yǎng)已知有支原體污染的培養(yǎng)箱模擬細(xì)胞的獲得性支原體感染，并研究RNC-rRNA在此模型中的改變，從而探索RNC-rRNA組成改變的特異性，以及用于檢測支原體污染的實(shí)用性。我們復(fù)蘇了支原體陰性的HBE細(xì)胞，其初始階段提取的RNC-RNA結(jié)果表現(xiàn)為正常的rRNA帶型以及正常的rRNA條帶的灰度值。在存在支原體污染的培養(yǎng)環(huán)境中，未進(jìn)行抗支原體處理經(jīng)4次細(xì)胞傳代后，再次收集該 HBE細(xì)胞提取的RNCRNA，電泳圖顯示細(xì)胞內(nèi)成熟核糖體rRNA組成發(fā)生與圖1相似的變化，其灰度值分析出現(xiàn)了16S和Unknown條帶，見圖2。這表明我們可有效利用RNC-rRNA帶型發(fā)現(xiàn)支原體的獲得性污染。

Figure 2.Acquired mycoplasma contamination of HBE cells.MP－:mycoplasma negativa;MP+:mycoplasma positive.圖2 HBE細(xì)胞的獲得性支原體污染

3 抗支原體治療可逆轉(zhuǎn)RNC-rRNA組成的變化

隨后，我們試圖回答，抗支原體治療是否可逆轉(zhuǎn)RNC-rRNA的異常組成，以進(jìn)一步輔助證明支原體對翻譯影響的特異性。因此，我們對本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)多個(gè)不同組織來源的細(xì)胞株進(jìn)行了測試。在肺癌A549中，支原體陽性細(xì)胞的RNC-RNA提取結(jié)果均顯示出異常的成熟核糖體rRNA組分;然而，經(jīng)治療RNC-rRNA的帶型逆轉(zhuǎn)為正常，表現(xiàn)為16S和Unknown條帶的消失，以及真核28S和18S條帶的灰度值恢復(fù)。在支原體陽性的肝癌Hep3B、HCCLM3和HCCLM6細(xì)胞中，我們也觀察到了異常的RNC-rRNA條帶和灰度值改變;經(jīng)抗支原體治療，這些異常RNC-rRNA恢復(fù)為正常狀態(tài)，見圖3。

Figure 3.Anti-mycoplasma treatment reversed the mycoplasma-mediated aberrant RNC-rRNA compositions.圖3 抗支原體治療后恢復(fù)人細(xì)胞株RNC-rRNA的組成

4 支原體污染影響宿主細(xì)胞MAPK通路

支原體感染可通過活化多種真核宿主細(xì)胞的MAPK途徑［9］，并可介導(dǎo) 28S rRNA的合成和降解［10］。為此，我們選擇了2株經(jīng)過檢測分別確證為支原體陰性與陽性的肺癌A549細(xì)胞，提取其全蛋白，并以Western blot檢測其中MAPK通路激活狀態(tài)改變。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與支原體陰性的細(xì)胞相比，受支原體污染的A549細(xì)胞中，總p38和磷酸化p38比率(p38/p-p38)顯著升高(P＜0.01)，而(ERK1/2)/(p-ERK1/2)比率無顯著變化(P＞0.05)。這表明p38 MAPK途徑在支原體感染下受到抑制，而ERK途徑不受影響。同時(shí)，Western blot結(jié)果顯示A549細(xì)胞的JNK蛋白表達(dá)量在檢測精度以下，見圖4。

Figure 4.Mycoplasma infection altered the MAPK signaling pathway in A549 cells.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs MP－.圖4 支原體污染對A549細(xì)胞MAPK通路的影響

討 論

支原體對宿主細(xì)胞核糖體rRNA的影響曾被多次報(bào)道［11］，這些研究主要利用高靈敏度的放射自顯影方法證明宿主細(xì)胞內(nèi)存在低豐度的原核生物特征性16S和23S rRNA［12］。鑒于支原體污染具普遍性［13］，且目前常規(guī)細(xì)胞總RNA提取和凝膠檢測結(jié)果中上述原核生物特征性條帶并不常見，原因是在細(xì)胞水平上支原體所產(chǎn)生的原核核糖體在數(shù)量上并無優(yōu)勢。相反，本研究通過蔗糖緩沖離心分離出成熟的核糖體［4］，發(fā)現(xiàn)在支原體污染樣品中，原核特征性rRNA條帶所占比例明顯增加，該現(xiàn)象表明宿主細(xì)胞內(nèi)原核核糖體在成熟核糖體組分中所占比例明顯上升。

細(xì)胞內(nèi)核糖體的裝配與蛋白質(zhì)翻譯這一過程受嚴(yán)格調(diào)控，目前已知真核細(xì)胞內(nèi)參與核糖體裝配的因子有170種以上［14］。同樣，支原體誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生廣泛而深刻的改變［3］，因此，我們認(rèn)為支原體完全可能具干擾宿主細(xì)胞的核糖體裝配的潛力，但目前尚無直接證據(jù)支持這一假說。作為該假說的支持證據(jù)，本研究觀測到不同細(xì)胞株中各rRNA條帶所占比例差異較大，部分支原體陽性樣品中真核生物rRNA特征性條帶灰度值與背景值相近。由于在核酸總量上支原體陽性樣本與陰性樣本一致，可排除分離能力飽和的可能性。此外，在部分樣品中出現(xiàn)高豐度的Unknown條帶，膠圖上指示該條帶長度(約700 bp，相當(dāng)于1 400 nt)與目前已知的真核或原核生物rRNA長度均不一致，提示其中可能存在新的核糖體組裝方式。

上述現(xiàn)象在常規(guī)的總RNA提取中難以發(fā)現(xiàn)，因此，本研究結(jié)果首次報(bào)道了支原體污染中，人類細(xì)胞的28S和18S RNC-rRNA下降的現(xiàn)象。MAPK通路是細(xì)胞中多種生物進(jìn)程的重要調(diào)控因素［15-16］，且MAPK通路改變被認(rèn)為與rRNA的合成和降解有機(jī)制聯(lián)系［10］。我們在本研究中所有細(xì)胞株均發(fā)現(xiàn)了相同的RNC-rRNA變化，并進(jìn)而以A549細(xì)胞為例證展開了研究。我們的結(jié)果驗(yàn)證了支原體污染介導(dǎo)的p38 MAPK途徑抑制與28S和18S RNC-rRNA降低的關(guān)系。其實(shí)，真核細(xì)胞rRNA合成高度依賴細(xì)胞外成纖維細(xì)胞生長因子-1(fibroblast growth factor 1，F(xiàn)GF1)和FGF-2的入胞和細(xì)胞核轉(zhuǎn)位［17］。其中，核內(nèi)FGF-2更可與上游結(jié)合因子(upstream binding factor，UBF)形成復(fù)合體，直接發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能以介導(dǎo)rRNA轉(zhuǎn)錄［18］。FGF-1和FGF-2的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位已知高度依賴p38 MAPK途徑的活化［17］。因此，本研究機(jī)制部分可歸納為，支原體感染可抑制p38磷酸化，進(jìn)而阻斷FGF-1和FGF-2入核，從而降低rRNA的合成，最終影響RNC-rRNA的組成。

由于支原體感染的隱蔽性與感染清除的復(fù)雜性，目前對受感染細(xì)胞株的首選處理方式是進(jìn)行庫存替換［19］，實(shí)際科研工作中對支原體感染以預(yù)防為主，故需要簡單有效的檢測手段對培養(yǎng)中的細(xì)胞污染情況進(jìn)行定期檢查。目前常用的支原體檢測方法有 PCR 法［20］、ELISA 法［21］和核酸染色法［22］，其中PCR法以其較高的準(zhǔn)確率與相對較低的成本和耗時(shí)被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的日常檢測中［23］。然而PCR法與ELISA法均依賴于已知的病原體信息，因而在理論上存在檢測盲區(qū)。本研究所用的方法在原理上不存在上述檢測盲區(qū)，同時(shí)成本低廉、操作簡便，能夠成為支原體檢測的輔助手段。

綜上，本研究首次報(bào)道了支原體污染對人細(xì)胞株成熟核糖體rRNA組成的影響，并在A549細(xì)胞中驗(yàn)證了p38 MAPK在其中扮演重要角色。因此，本研究為支原體感染狀態(tài)下真核細(xì)胞的病理生理研究提供了一定的方向指引。同時(shí)本研究所用的方法與已有支原體檢測手段相比具有一定優(yōu)勢，可開發(fā)為新的支原體檢測手段。

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