王 青， 羅彥彰， 林修賢， 榮冬秀， 張 濤， 王 通， 崔毅峙

細胞體外培養(yǎng)模型是病理生理研究中不可或缺的工具，然而，實驗室支原體污染在世界范圍內(nèi)廣泛流行，其在體外組織培養(yǎng)的污染率高達5% ～35%［1-2］。支原體是已知最小的原核生物，直徑多為0.1 ～0.3 μm，能夠通過除菌濾膜(0.22 μm)，其唯一可見的細胞器是核糖體。受非致病性支原體污染的細胞株往往沒有明顯的形態(tài)或培養(yǎng)基變化［3］，因而常被忽視。但是，科研界公認的標準是，以有支原體污染的組織培養(yǎng)模型得到的科學結論被認為是假象。

我們在以往的工作中成功建立了真核細胞翻譯組學和蛋白質組學的研究平臺，并利用該策略闡明了在穩(wěn)態(tài)腫瘤細胞中存在長度依賴的翻譯偏好現(xiàn)象，以及闡述了這種偏好與腫瘤細胞的表型密切相關［4］。該策略的技術內(nèi)核是人細胞的核糖體新生肽鏈復合物(ribosome nascent-chain complex，RNC)的分離和提取，從而研究RNC結合的翻譯中mRNA(RNC-mRNA)的組學規(guī)律。RNC中包含的是已裝配完畢的成熟核糖體。

Levine等［5］曾報道支原體感染會引起總RNA組分中的核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA)相對含量的改變。我們實踐中發(fā)現(xiàn)支原體污染的細胞總RNA組分改變并不顯著，然而成熟核糖體中RNC-rRNA的變化尚未見報道。由于支原體富含核糖體且具改變細胞表型能力，我們假設支原體污染會引起宿主細胞的RNC-rRNA組成發(fā)生改變。回答該問題不但可在翻譯層面闡述支原體輸入對人細胞的影響，同時可探索RNC-rRNA作為支原體污染檢測的可行性;進而，也有望為評價支原體污染臨床治療的療效提供一條新途徑。因此，本研究利用RNC分離技術從人類細胞株中分離得到成熟的核糖體，并研究實驗室支原體污染對RNC-rRNA組成的改變，并初步探索了絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途徑在該過程中的可能作用。

材料和方法

1 材料

1.1 主要材料 HBE、H1299和 A549細胞購自ATCC;Hep3B、HCCLM3、HCCLM6 細胞來自復旦大學中山醫(yī)院;超速離心機及SW60 Ti轉子購自Beckman;瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)購自北京市六一儀器廠;SDS-PAGE及轉膜系統(tǒng)購自Bio-Rad，PVDF膜購自Millipore。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco，瓊脂糖購自 Invitrogen;KCl、MgCl2、HEPES、KOH 和蔗糖購自天津市大茂化學試劑廠;放線菌酮(cycloheximide，CHX)和SDS裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司;DTT購自廣州捷倍斯生物科技有限公司;Triton X-100購自Sigma;支原體檢測試劑盒購自上海依科賽生物制品有限公司;ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK 和p-JNK抗體購自CST，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體和Ⅱ抗購自Bioworld。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) HBE、A549、H1299、Hep3B、HCCLM3和HCCLM6細胞按照我們已發(fā)表的方法進行培養(yǎng)［4，6］。

2.2 支原體污染的治療 根據(jù)文獻［7］方法，在被支原體污染的細胞培養(yǎng)基中加入環(huán)丙沙星，終濃度為10 mg/L，連續(xù)傳代培養(yǎng)7代后進行再次檢驗。

2.3 支原體的PCR檢測 依照支原體檢測試劑盒說明書進行PCR檢測。用無抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，待細胞生長至80%以上。取1 mL細胞培養(yǎng)上清，放入離心管中。13 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS洗沉淀1次。加入100 μL裂解液裂解細胞，上下顛倒混勻后，室溫放置5 min。細胞裂解液95℃處理5 min。13 000 r/min離心5 min，上清轉入新離心管。取2 μL上清作為模板進行PCR反應:95℃ 30 s;95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個循環(huán);72℃ 5 min。

2.4 真核細胞RNC提取 依照我們發(fā)表的方法提取真核細胞RNC［4］。細胞在T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2 d后，在培養(yǎng)基中加入CHX，至終濃度100 mg/L，放入培養(yǎng)箱中孵育15 min。將培養(yǎng)瓶轉移至冰上，棄去上清，用4℃預冷的PBS洗滌2次。在瓶中加入500 μL裂解液(20 mmol/L HEPES-KOH，15 mmol/L MgCl2，200 mmol/L KCl，100 mg/L CHX，2 mmol/L DTT和1%Triton X-100，置于冰上裂解30 min。刮下細胞，收集裂解液，16 200 ×g，4℃離心10 min。在超速離心管中加入30%蔗糖溶液2 mL，沿管壁緩慢加入細胞裂解液500 μL(蔗糖與裂解液比例不得小于3∶1)。185 000 ×g，4 °C 離心3 h，棄上清，用100 μL Buffer RB(20 mmol/L HEPES-KOH，15 mmol/L MgCl2，200 mmol/L KCl，100 mg/L CHX，2 mmol/L DTT)重懸沉淀，并轉移至預冷的EP管中。2.5 RNC-RNA提取 用TRIzol Reagent提取RNCRNA。在2.4中得到的RNC中加入1 mL TRIzol Reagent，充分混勻后室溫靜置3 min。加入200 μL氯仿，渦旋混勻15 s，室溫靜置5 min。12 000×g，4℃離心15 min，溶液分為3層，小心吸取水相層，轉移至新的EP管中，加入1倍體積的異丙醇，混勻后－20℃靜置過夜。12 000 ×g，4℃離心30 min，用－20℃預冷的75%乙醇洗滌沉淀物2次，風干乙醇后加入 30 μL RNase-free H2O。

2.6 瓊脂糖凝膠電泳 以標準瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNC-RNA，凝膠濃度為2%，每孔上樣量為1 μg，90 V電泳約1 h。用 SYBR-Green II染色后用290 nm紫外光激發(fā)照相獲取RNC-RNA條帶圖譜。2.7 Western blot 細胞樣品用SDS裂解液裂解提取總蛋白，10%SDS-PAGE分離蛋白，濃縮膠中60 V電泳30 min，分離膠中80 V電泳2 h。取出凝膠，以230 mA恒流轉膜1.5 h。5% 脫脂牛奶封閉1 h，Ⅰ抗以1∶1 000稀釋，4℃過夜，Ⅱ抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育1 h，顯影。

3 統(tǒng)計學處理

瓊脂糖凝膠電泳圖在ImageJ軟件中測定各泳道內(nèi)各截面的總灰度值［8］;數(shù)據(jù)以Matlab R2013a軟件分析并作圖。Western blot實驗中，用ImageJ軟件測量蛋白條帶灰度值。以GAPDH條帶灰度值對目的條帶灰度值歸一化，使用GraphPad Prism 6.01軟件進行統(tǒng)計檢驗。我們采用雙尾配對t檢驗以排除不同膠片曝光參數(shù)不同帶來的誤差。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 支原體污染對H1299和A549細胞的RNC-rRNA組成影響

我們以PCR方法分別對本實驗室培養(yǎng)的2株肺來源癌細胞株H1299和A549進行檢測，結果顯示該H1299細胞呈支原體陰性(表現(xiàn)為280 bp條帶陰性，150 bp條帶陽性)，而A549細胞受支原體污染(280 bp和150 bp條帶雙陽性)。我們分別提取了這2株細胞的RNC并從中分離出RNC-RNA，瓊脂糖凝膠電泳圖顯示，支原體陰性細胞株H1299具有清晰的28S(～4 700 nt)和18S(～1 900 nt)條帶，為典型真核生物rRNA帶型;相反，A549細胞RNC-rRNA帶型發(fā)生明顯改變，28S條帶灰度值明顯下降，同時在約1 540 nt處出現(xiàn)典型的原核生物16S rRNA特征性條帶，此外在約700 bp處出現(xiàn)1條來源不明的條帶，以下稱Unknown條帶?；叶确治霰砻?，支原體陽性細胞RNC-RNA中28S和18S rRNA條帶所占比例大幅減少，相反16S rRNA和Unknown條帶所占比例明顯上升，見圖1。

Figure 1.Decreases in 28S and 18S rRNA in the RNC-RNA fraction of mycoplasma-contaminated human H1299 and A549 cells.圖1 支原體污染降低人肺癌H1299和A549細胞株RNC-RNA中的28S和18S rRNA

2 RNC-rRNA組成變化的獲得性實驗

我們進而利用本實驗室專用于培養(yǎng)已知有支原體污染的培養(yǎng)箱模擬細胞的獲得性支原體感染，并研究RNC-rRNA在此模型中的改變，從而探索RNC-rRNA組成改變的特異性，以及用于檢測支原體污染的實用性。我們復蘇了支原體陰性的HBE細胞，其初始階段提取的RNC-RNA結果表現(xiàn)為正常的rRNA帶型以及正常的rRNA條帶的灰度值。在存在支原體污染的培養(yǎng)環(huán)境中，未進行抗支原體處理經(jīng)4次細胞傳代后，再次收集該 HBE細胞提取的RNCRNA，電泳圖顯示細胞內(nèi)成熟核糖體rRNA組成發(fā)生與圖1相似的變化，其灰度值分析出現(xiàn)了16S和Unknown條帶，見圖2。這表明我們可有效利用RNC-rRNA帶型發(fā)現(xiàn)支原體的獲得性污染。

Figure 2.Acquired mycoplasma contamination of HBE cells.MP－:mycoplasma negativa;MP+:mycoplasma positive.圖2 HBE細胞的獲得性支原體污染

3 抗支原體治療可逆轉RNC-rRNA組成的變化

隨后，我們試圖回答，抗支原體治療是否可逆轉RNC-rRNA的異常組成，以進一步輔助證明支原體對翻譯影響的特異性。因此，我們對本實驗室內(nèi)多個不同組織來源的細胞株進行了測試。在肺癌A549中，支原體陽性細胞的RNC-RNA提取結果均顯示出異常的成熟核糖體rRNA組分;然而，經(jīng)治療RNC-rRNA的帶型逆轉為正常，表現(xiàn)為16S和Unknown條帶的消失，以及真核28S和18S條帶的灰度值恢復。在支原體陽性的肝癌Hep3B、HCCLM3和HCCLM6細胞中，我們也觀察到了異常的RNC-rRNA條帶和灰度值改變;經(jīng)抗支原體治療，這些異常RNC-rRNA恢復為正常狀態(tài)，見圖3。

Figure 3.Anti-mycoplasma treatment reversed the mycoplasma-mediated aberrant RNC-rRNA compositions.圖3 抗支原體治療后恢復人細胞株RNC-rRNA的組成

4 支原體污染影響宿主細胞MAPK通路

支原體感染可通過活化多種真核宿主細胞的MAPK途徑［9］，并可介導 28S rRNA的合成和降解［10］。為此，我們選擇了2株經(jīng)過檢測分別確證為支原體陰性與陽性的肺癌A549細胞，提取其全蛋白，并以Western blot檢測其中MAPK通路激活狀態(tài)改變。3次重復實驗結果表明，與支原體陰性的細胞相比，受支原體污染的A549細胞中，總p38和磷酸化p38比率(p38/p-p38)顯著升高(P＜0.01)，而(ERK1/2)/(p-ERK1/2)比率無顯著變化(P＞0.05)。這表明p38 MAPK途徑在支原體感染下受到抑制，而ERK途徑不受影響。同時，Western blot結果顯示A549細胞的JNK蛋白表達量在檢測精度以下，見圖4。

Figure 4.Mycoplasma infection altered the MAPK signaling pathway in A549 cells.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs MP－.圖4 支原體污染對A549細胞MAPK通路的影響

討 論

支原體對宿主細胞核糖體rRNA的影響曾被多次報道［11］，這些研究主要利用高靈敏度的放射自顯影方法證明宿主細胞內(nèi)存在低豐度的原核生物特征性16S和23S rRNA［12］。鑒于支原體污染具普遍性［13］，且目前常規(guī)細胞總RNA提取和凝膠檢測結果中上述原核生物特征性條帶并不常見，原因是在細胞水平上支原體所產(chǎn)生的原核核糖體在數(shù)量上并無優(yōu)勢。相反，本研究通過蔗糖緩沖離心分離出成熟的核糖體［4］，發(fā)現(xiàn)在支原體污染樣品中，原核特征性rRNA條帶所占比例明顯增加，該現(xiàn)象表明宿主細胞內(nèi)原核核糖體在成熟核糖體組分中所占比例明顯上升。

細胞內(nèi)核糖體的裝配與蛋白質翻譯這一過程受嚴格調控，目前已知真核細胞內(nèi)參與核糖體裝配的因子有170種以上［14］。同樣，支原體誘導宿主細胞發(fā)生廣泛而深刻的改變［3］，因此，我們認為支原體完全可能具干擾宿主細胞的核糖體裝配的潛力，但目前尚無直接證據(jù)支持這一假說。作為該假說的支持證據(jù)，本研究觀測到不同細胞株中各rRNA條帶所占比例差異較大，部分支原體陽性樣品中真核生物rRNA特征性條帶灰度值與背景值相近。由于在核酸總量上支原體陽性樣本與陰性樣本一致，可排除分離能力飽和的可能性。此外，在部分樣品中出現(xiàn)高豐度的Unknown條帶，膠圖上指示該條帶長度(約700 bp，相當于1 400 nt)與目前已知的真核或原核生物rRNA長度均不一致，提示其中可能存在新的核糖體組裝方式。

上述現(xiàn)象在常規(guī)的總RNA提取中難以發(fā)現(xiàn)，因此，本研究結果首次報道了支原體污染中，人類細胞的28S和18S RNC-rRNA下降的現(xiàn)象。MAPK通路是細胞中多種生物進程的重要調控因素［15-16］，且MAPK通路改變被認為與rRNA的合成和降解有機制聯(lián)系［10］。我們在本研究中所有細胞株均發(fā)現(xiàn)了相同的RNC-rRNA變化，并進而以A549細胞為例證展開了研究。我們的結果驗證了支原體污染介導的p38 MAPK途徑抑制與28S和18S RNC-rRNA降低的關系。其實，真核細胞rRNA合成高度依賴細胞外成纖維細胞生長因子-1(fibroblast growth factor 1，F(xiàn)GF1)和FGF-2的入胞和細胞核轉位［17］。其中，核內(nèi)FGF-2更可與上游結合因子(upstream binding factor，UBF)形成復合體，直接發(fā)揮轉錄因子功能以介導rRNA轉錄［18］。FGF-1和FGF-2的細胞核轉位已知高度依賴p38 MAPK途徑的活化［17］。因此，本研究機制部分可歸納為，支原體感染可抑制p38磷酸化，進而阻斷FGF-1和FGF-2入核，從而降低rRNA的合成，最終影響RNC-rRNA的組成。

由于支原體感染的隱蔽性與感染清除的復雜性，目前對受感染細胞株的首選處理方式是進行庫存替換［19］，實際科研工作中對支原體感染以預防為主，故需要簡單有效的檢測手段對培養(yǎng)中的細胞污染情況進行定期檢查。目前常用的支原體檢測方法有 PCR 法［20］、ELISA 法［21］和核酸染色法［22］，其中PCR法以其較高的準確率與相對較低的成本和耗時被廣泛應用于實驗室的日常檢測中［23］。然而PCR法與ELISA法均依賴于已知的病原體信息，因而在理論上存在檢測盲區(qū)。本研究所用的方法在原理上不存在上述檢測盲區(qū)，同時成本低廉、操作簡便，能夠成為支原體檢測的輔助手段。

綜上，本研究首次報道了支原體污染對人細胞株成熟核糖體rRNA組成的影響，并在A549細胞中驗證了p38 MAPK在其中扮演重要角色。因此，本研究為支原體感染狀態(tài)下真核細胞的病理生理研究提供了一定的方向指引。同時本研究所用的方法與已有支原體檢測手段相比具有一定優(yōu)勢，可開發(fā)為新的支原體檢測手段。

［1］ Young L，Sung J，Stacey G，et al.Detection of Mycoplasma in cell cultures［J］.Nat Protoc，2010，5(5):929-934.

［2］ Drexler HG，Uphoff CC.Mycoplasma contamination of cell cultures:incidence， sources， effects， detection，elimination，prevention［J］.Cytotechnology，2002，39(2):75-90.

［3］ Rottem S.Interaction of mycoplasmas with host cells［J］.Physiol Rev，2003，83(2):417-432.

［4］ Wang T，Cui Y，Jin J，et al.Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific［J］.Nucleic Acids Res，2013，41(9):4743-4754.

［5］ Levine EM，Thomas L，Mcgregor D，et al.Altered nucleic acid metabolism in human cell cultures infected with mycoplasma［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1968，60(2):583-589.

［6］ Chang C，Li L，Zhang C，et al.Systematic analyses of the transcriptome，translatome，and proteome provide a global view and potential strategy for the C-HPP［J］.J Proteome Res，2014，13(1):38-49.

［7］ Schmitt K，Daubener W，Bitter-Suermann D，et al.A safe and efficient method for elimination of cell culture mycoplasmas using ciprofloxacin［J］.J Immunol Methods，1988，109(1):17-25.

［8］ Schneider CA，Rasband WS，Eliceiri KW.NIH Image to ImageJ:25 years of image analysis［J］.Nat Methods，2012，9(7):671-675.

［9］ Rawadi G，Ramez V，Lemercier B，et al.Activation of mitogen-activated protein kinase pathways by Mycoplasma fermentans membrane lipoproteins in murine macrophages:involvement in cytokine synthesis［J］.J Immunol，1998，160(3):1330-1339.

［10］Laskin JD，Heck DE，Laskin DL.The ribotoxic stress response as a potential mechanism for MAP kinase activation in xenobiotic toxicity［J］.Toxicol Sci，2002，69(2):289-291.

［11］ Stanbridge E.Mycoplasmas and cell cultures［J］.Bacteriol Rev，1971，35(2):206-227.

［12］ Markov GG，Bradvarova I，Mintcheva A，et al.Mycoplasma contamination of cell cultures:interference with32P-labelling pattern of RNA［J］.Exp Cell Res，1969，57(2-3):374-384.

［13］Hwang JM，Lee JH，Yeh JY.A multi-laboratory profile of Mycoplasma contamination in Lawsonia intracellularis cultures［J］.BMC Res Notes，2012，5:78.

［14］ Fromont-Racine M，Senger B，Saveanu C，et al.Ribosome assembly in eukaryotes［J］.Gene，2003，313:17-42.

［15］來麗娜，宋麗華，張曉京，等.ROS/PKC/p38 MAPK途徑在山茱萸多糖抑制心肌細胞缺氧/復氧損傷的作用［J］.中國病理生理雜志，2014，30(12):2201-2205.

［16］潘霄羽，王 燕，黃高翔，等.TGF-β1激活的 p38 MAPK在TGF-β1上調人卵巢癌細胞PAI-1表達中的作用［J］.中國病理生理雜志，2015，31(2):284-288.

［17］Sorensen V，Zhen Y，Zakrzewska M，et al.Phosphorylation of fibroblast growth factor(FGF)receptor 1 at Ser777 by p38 mitogen-activated protein kinase regulates translocation of exogenous FGF1 to the cytosol and nucleus［J］.Mol Cell Biol，2008，28(12):4129-4141.

［18］ Sheng Z，Liang Y，Lin CY，et al.Direct regulation of rRNA transcription by fibroblast growth factor 2［J］.Mol Cell Biol，2005，25(21):9419-9426.

［19］Uphoff CC，Denkmann SA，Drexler HG.Treatment of mycoplasma contamination in cell cultures with Plasmocin［J］.J Biomed Biotechnol，2012，2012:267678.

［20］Uphoff CC，Drexler HG.Detection of mycoplasma in leukemia-lymphoma cell lines using polymerase chain reaction［J］.Leukemia，2002，16(2):289-293.

［21］ Feld NC，Qvist P，Ahrens P，et al.A monoclonal blocking ELISA detecting serum antibodies to Mycoplasma hyopneumoniae［J］.Vet Microbiol，1992，30(1):35-46.

［22］ Battaglia M，Pozzi D，Grimaldi S，et al.Hoechst 33258 staining for detecting mycoplasma contamination in cell cultures:a method for reducing fluorescence photobleaching［J］.Biotech Histochem，1994，69(3):152-156.

［23］ Uphoff CC，Drexler HG.Comparative PCR analysis for detection of mycoplasma infections in continuous cell lines［J］.In Vitro Cell Dev Biol Anim，2002，38(2):79-85.