陳珍珍等

[摘要] 目的 建立復(fù)方醋酸氟輕松乳膏中尿囊素和冰片的定量方法。 方法 尿囊素采用Intersil ODS-3 C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇：水（2：98），檢測波長為210nm，流速為1.0mL/min，外標(biāo)法計(jì)算。冰片以水楊酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物，采用氣相色譜法，DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（30m×0.53mm×1.0μm），柱溫130℃，進(jìn)樣口溫度220℃，F(xiàn)ID檢測器，檢測器溫度為280℃。 結(jié)果 尿囊素和冰片的線性范圍分別為0.05015～1.003 mg/mL和0.4728～4.728mg/mL，回歸方程分別為Y=130310X+1418.5（r=0.9998）和Y=1.2213X-0.0082（r=1.0000）。尿囊素和冰片的平均回收率分別為102.12%（RSD=0.59%）和100.25%（RSD=0.60%）。 結(jié)論 本方法簡便、快捷，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于本制劑的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 復(fù)方醋酸氟輕松乳膏；尿囊素；冰片；高效液相色譜法；氣相色譜法

[中圖分類號(hào)] R927.11 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2015）13-33-04

[Abstract] Objective To establish a method for the determination of allantoin and borneol in compound fluocinonide cream. Methods Allantoin was detected by Intersil ODS-3 C18 column（250mm×4.6mm， 5μm） with methanol-water（2：98） as the mobile phase at the flow rate of 1.0mL/min. The detection wavelength was at 210 nm. It was calculated by the external standard method. Borneol. Methyl salicylate was selected as internal standard. Gas chromatography was adopted. The column was DB-WAX capillary column （30m×0.53mm×1.0μm） and column temperature was 130℃. The injector temperature was 220℃ and the detector was FID whose temperature was 280℃. Results The linear range of allantoin and borneol were 0.05015 to 1.003mg/mL and 0.4728 to 4.728mg/mL. Regression equations were Y=130310X+1418.5（r=0.9998） and Y=1.2213X-0.0082（r=1.0000） respectively. The average recovery of allantoin and borneol were 102.12%（RSD=0.59%）and 100.25%（RSD=0.60%）respectively. Conclusion The method is simple， rapid， sensitive， accurate and reliable which can be used for quality control of compound fluocinonide cream.

[Key words] Compound fluocinonide cream； Allantoin； Borneol； High Performance Liquid Chromatography； Gas chromatography

復(fù)方醋酸氟輕松乳膏為《中國人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》[1]（2002）版收載的品種，用途為止癢抗過敏，用于急性、亞急性、慢性濕疹，皮膚瘙癢癥，過敏性皮炎。本品種為復(fù)方制劑，處方中有醋酸氟輕松、氯霉素、冰片、氧化鋅、尿囊素五個(gè)成分，但現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)中只有醋酸氟輕松和氯霉素的含量測定。為更好的控制該品種的質(zhì)量，根據(jù)軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高計(jì)劃課題2013年度檢查評(píng)估會(huì)有關(guān)事項(xiàng)，本次針對(duì)尿囊素、冰片進(jìn)行研究，建立了含量測定方法并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好，從而可以更好地有效地控制醋酸氟輕松乳膏的內(nèi)在質(zhì)量。

1 材料與方法

LC-2010A高效液相色譜儀、DAD檢測器（日本島津有限公司），Aglient 7890氣相色譜儀、氫火焰離子化檢測器（美國安捷倫科技有限公司）。

尿囊素對(duì)照品、冰片對(duì)照品及水楊酸甲酯對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為：11501-200202、110743-200905、110707-201112。復(fù)方醋酸氟輕松乳膏樣品以及空白輔料來自沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，樣品批號(hào)分別為20130520、20130522。甲醇和乙酸乙酯均為色譜純試劑。

2 尿囊素含量測定結(jié)果

參照文獻(xiàn)報(bào)道[2-6]有關(guān)尿囊素的含量測定方法，確定采用高效液相色譜法，方法如下。

2.1 色譜條件

色譜柱：Intersil ODS-3 C18（250mm×4.6mm，5μm）。

流動(dòng)相：甲醇：水（2：98）；檢測波長：210nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

理論板數(shù)按尿囊素計(jì)算為7095。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取尿囊素對(duì)照品10mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取復(fù)方醋酸氟輕松乳膏1g，精密稱定，置50mL量瓶中，加水適量，置80℃水浴中加熱5min，振搖使溶解，放冷至室溫，用水稀釋至刻度，搖勻，至冰浴中冷卻15min，取出，濾過，濾液放至室溫，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性溶液 取空白基質(zhì)約1g，與樣品同法處理，作為陰性溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性 取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，結(jié)果表明陰性溶液無干擾。見圖1。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密稱取尿囊素對(duì)照品配制成不同標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度。精密量取上述供試液10?L，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積對(duì)濃度做線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，尿囊素回歸方程為Y=130310X+1418.5，r=0.9998，結(jié)果表明，尿囊素濃度在0.05015～1.003mg/mL，線性良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 按上述色譜條件，精密吸取尿囊素對(duì)照品溶液10?l進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積的RSD%（n=6），為0.05%。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取重復(fù)性項(xiàng)下的供試品溶液分別于0、1、3、5、7、9、11、13、15、17、24h進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，考察尿囊素峰面積RSD，室溫下，樣品溶液中尿囊素峰面積24h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD%為1.59%，滿足測定要求。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取復(fù)方醋酸氟輕松乳膏（批號(hào)20130522）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果6份樣品中尿囊素含量RSD為0.91%。

2.3.6 回收率試驗(yàn) 采用模擬回收實(shí)驗(yàn)。分別精密稱取原料適量（相當(dāng)于尿囊素8、10、12mg），置50mL的量瓶中，加入空白輔料1g，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別制得濃度為80%、100%、120%的供試品溶液。按上述色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率，結(jié)果表明低濃度溶液（80%）、中間濃度溶液（100%）、高濃度溶液（120%），各個(gè)樣品中尿囊素的的回收率均在98.0%～103.0%，平均回收率102.12%，RSD為0.59%，滿足測定要求。

2.4 討論

考慮尿囊素的溶解性，能溶于熱水，故選擇用水作為溶劑，在80℃水浴中加熱溶解。用水作為溶劑時(shí)，不同提取時(shí)間，含量有差異。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，5min的含量最高，10min后無明顯變化，故選擇水浴時(shí)間為5min。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，軟膏基質(zhì)對(duì)色譜柱有較大的損害，如果不除去基質(zhì)，長時(shí)間進(jìn)樣后色譜峰的分離效果會(huì)變差，理論板數(shù)也會(huì)下降，考慮到冷凍可以除去基質(zhì)，故將樣品冷凍后濾過，放置到室溫進(jìn)行測定。

另外考察了不同廠家的色譜柱（Thermo BDS HYPERSIL C18，5μm 4.6mm×250mm）進(jìn)行試驗(yàn)，選擇不同的儀器（Waters2695高效液相色譜），結(jié)果均表明分離度良好，樣品含量值較穩(wěn)定，理論板數(shù)符合要求，說明方法耐用性良好。

3 冰片含量測定結(jié)果

參照《中國藥典》2010年版一部[7-9]及文獻(xiàn)報(bào)道[7-12]有關(guān)冰片的含量測定方法，確定采用氣相色譜法，方法如下。

3.1 色譜條件

色譜柱：DB-WAX氣相色譜柱（30m× 0.53mm× 1.0μm）

柱溫130℃，進(jìn)樣口溫度為220℃，檢測器溫度為280℃，氮?dú)饬魉贋?mL/min，氫氣的流速為30mL/min，空氣的流速為400mL/min。檢測器為FID。理論板數(shù)按水楊酸甲酯計(jì)算應(yīng)不低于2000，且冰片兩個(gè)色譜峰與水楊酸甲酯峰分離度應(yīng)符合要求。

3.2 溶液的制備

3.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液 稱取水楊酸甲酯對(duì)照品1.5g，置50mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.2.2 對(duì)照品溶液 取冰片對(duì)照品30mg，精密稱定，置25mL量瓶中，加乙酸乙酯適量使溶解，精密量取內(nèi)標(biāo)溶液1mL，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.2.3 供試品溶液 稱取本品約2.0g，精密稱定，置25mL量瓶中，精密量取內(nèi)標(biāo)溶液1mL，加乙酸乙酯適量超聲振搖，使冰片溶解，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.2.4 陰性溶液 稱取處方量的空白基質(zhì)約2.0g，置25mL量瓶中，加乙酸乙酯適量超聲振搖，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 專屬性 精密量取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、內(nèi)標(biāo)溶液、乙酸乙酯、陰性溶液各1μL，分別注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果表明空白輔料不干擾樣品的測定，內(nèi)標(biāo)溶液與冰片兩個(gè)色譜峰有效分離。

3.3.2 線性關(guān)系考察 稱取冰片對(duì)照品（含量98.0%）301.47mg，置25mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度約12mg/mL的溶液，作為冰片對(duì)照品貯備液。分別精密量取冰片對(duì)照品貯備液1、2、2.5、5、10mL，分別置25mL量瓶中，分別精密量取內(nèi)標(biāo)溶液1mL，用乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，作為線性供試品溶液。精密量取上述線性供試液各1μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)法以A對(duì)和/A內(nèi)的比值為縱坐標(biāo)，以冰片濃度為橫坐標(biāo)做線性回歸，計(jì)算回歸方程。冰片回歸方程為：Y=1.2213X-0.0082，相關(guān)系數(shù)r=1.0000，結(jié)果表明，冰片濃度在0.4728～4.728mg/mL范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系。

3.3.3 精密度試驗(yàn) 取含量測定用對(duì)照品溶液1μL進(jìn)樣，分別注入氣相色譜儀中，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積的RSD%。采用內(nèi)標(biāo)法，A和/A內(nèi)比值的平均值為1.4417，RSD%（n=6）為0.3%。