盧均坤 呂維娟 劉 洋 王燕琴 (佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 54002)

蒽環(huán)類抗生素是有效的抗腫瘤藥物，然而會對正常的組織造成損害。尤其是劑量依賴性的急性和延遲心肌損傷，在心肌損傷的病人中約有20%可引起充血性心力衰竭〔1〕。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)廣泛地調(diào)控著一系列基因的表達，尤其是調(diào)節(jié)參與免疫反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和凋亡等相關(guān)因子的基因表達〔2〕。姜黃素是一種天然的NF-κB抑制劑，能夠保護間充質(zhì)干細胞免受炎性細胞因子損害，姜黃素具有抑制多種炎癥因子的作用，谷胱甘肽可通過一些酶系，抑制脂質(zhì)過氧化作用的啟動和終止脂質(zhì)過氧化的發(fā)展，從而阻斷新自由基的產(chǎn)生〔3〕。本實驗探索阿霉素心肌損傷的機制及預(yù)防機制。

1 材料和方法

1.1 動物和試劑 健康12 w齡左右Wistar大鼠60只，雌雄不限，體重(250±28)g，由佳木斯大學(xué)實驗動物中心提供〔許可證號為SCXK(黑)2007－0001〕。阿霉素由浙江海正藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，姜黃素由陜西森弗生物技術(shù)有限公司;谷胱甘肽購自上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司;心肌酶檢測試劑盒、免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物分組 60只Wistar大鼠，隨機分為三組，每組20只，設(shè)空白對照組正常飼喂，腹腔注射等量生理鹽水。實驗組，按照1.25 mg/kg劑量腹腔注射阿霉素，隔日一次共計7次，累積劑量7.5 mg/kg。姜黃素谷胱甘肽干預(yù)組，阿霉素腹腔給藥同實驗組，但在化療前4 d開始給予姜黃素及谷胱甘肽鼠尾靜脈給予，每日一次，直到化療結(jié)束。

1.3 標(biāo)本收集 所有實驗大鼠，實驗結(jié)束后摘除眼球方法取血，在4℃，3000 r/min離心后取上清液，備用。留取大鼠左心室心臟標(biāo)本2%戊二醛及4%本甲醛固定，備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 一般情況檢測 觀察大鼠的一般精神狀況，飲食，皮毛和體重情況等。

1.4.2 血清心肌酶檢測 酶聯(lián)免疫吸附法測定，所有操作均按照試劑盒說明書進行。

1.4.3 組織病理學(xué)檢查 心肌組織4%甲醛固定24 h后以石蠟包埋，切成5 μm左右薄片，用HE進行染色，顯微鏡觀察心肌組織病變，以腫脹肥大程度及胞質(zhì)空泡變性程度來判定。

1.4.4 電鏡檢查 取左心室心肌部組織，2%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，Epon812包埋、切片至70～80 nm，鉛鈾電子染色，電鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu)。

1.4.5 免疫組化檢查 NF-κB、IκB均采用按試劑盒說明書進行操作:取4 μm厚10%甲醛固定的石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化，浸入3%過氧化氫(H2O2)5 min，PBS沖洗3次，滴加稀釋的一抗(NF-κB P65單克隆抗體和IκBα多克隆抗體均為 1∶50稀釋度)，滴加適量兔抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，DAB顯色。乙醇脫水，透明樹膠封片。心肌間質(zhì)細胞及細胞核內(nèi)染色強度評分:未著色、淺黃色、黃色、棕黃色分別計為0、1、2、3分;陽性細胞數(shù)為 ＞25%、25% ～50%、50% ～75%、＞75%分別計為0、1、2、3分;兩者之和 ＞2即為免疫組化陽性，計算陽性百分率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進行q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般狀況 空白對照組大鼠攝食、活動、糞便等一般狀況良好，體重增長較快，皮毛光滑;阿霉素組大鼠出現(xiàn)進食明顯減少、腹瀉，活動遲緩、體重增長緩慢、皮毛不光滑;姜黃素谷胱甘肽干預(yù)組較阿霉素組大鼠進食量增多，活動性較好，體重增長稍慢，皮毛不光滑。

2.2 心肌酶學(xué)變化 在三組大鼠中，阿霉素組血清心肌酶各指標(biāo)明顯高于空白對照組及姜黃素谷胱甘肽組(P＜0.05)，姜黃素谷胱甘肽組同空白對照組比較差異無顯著意義(P＞0.05)，見表1。

2.3 心肌組織結(jié)構(gòu)的病理學(xué)檢查 空白對照組:心肌組織未見明顯變性;阿霉素組:心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，部分心肌細胞肥大腫脹明顯，細胞內(nèi)可見均勻的細小紅染顆粒，并伴有水樣變性;姜黃素及谷胱甘肽干預(yù)組:心肌組織少部分心肌細胞腫脹肥大，細胞輕度水樣變性，見圖1。

表1 各組大鼠血清心肌酶學(xué)變化(±s，n=20)

表1 各組大鼠血清心肌酶學(xué)變化(±s，n=20)

與阿霉素組比較:1)P＜0.05

組別 CK(U/L) CK-MB(U/L) TnI(μg/L) LDH(U/L) AST(U/L).5437.5±32.8阿霉素組 768.6±137.5889.2±147.50.82±0.071 473.6±334.5815.4±102.4姜黃素谷胱甘肽組 523.7±131.81) 584.3±135.41) 0.41±0.061) 936.8±137.21) 523.6±95.71)空白對照組 467.4±124.3526.3±137.60.36±0.04842.3±94

2.4 線粒體電鏡檢查 電鏡檢查發(fā)現(xiàn)空白對照組大鼠心肌線粒體排列整齊、皺褶比較多、峭完整;阿霉素組大鼠心肌線粒體增生、排列紊亂、腫脹、畸形，峭減少、肌漿網(wǎng)擴張、空泡化明顯;姜黃素谷胱甘肽干預(yù)組大鼠心肌線粒體增生、排列紊亂、腫脹程度較單純阿霉素明顯減輕、嵴較單純阿霉素組增多、有少量空泡變性，見圖2。

2.5 免疫組化檢查 在各組大鼠心臟組織中NF-κB蛋白的表達與IκB蛋白的表達的相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，空白對照組大鼠心肌細胞有少量NF-κB蛋白表達和較多IκB蛋白表達;阿霉素組大鼠中NF-κB蛋白表達陽性率明顯升高，IκB蛋白表達明顯下降;在姜黃素谷胱甘肽組表達較阿霉素組NF-IκB蛋白表達明顯降低、IκB蛋白顯著增加(P＜0.05)，同空白對照組比較差別無顯著意義(P＞0.05)，見表2。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)檢查(HE，×200)

圖2 各組大鼠心肌線粒體電鏡檢查(×9000)

表2 NF-κB/IκB在大鼠心肌中的表達(%，±s，n=20)

表2 NF-κB/IκB在大鼠心肌中的表達(%，±s，n=20)

與阿霉素組比較:1)P＜0.05

組別 NF-κB IκB 6.06±0.4842.08±6.26阿霉素組 47.34±1.0511.29±1.17姜黃素谷胱甘肽組 12.17±0.541) 35.23±7.041)空白對照組

3 討論

蒽環(huán)類藥物屬于抗生素類藥物，抑制惡性腫瘤的作用是通過插入DNA雙鏈、抑制拓撲異構(gòu)酶Ⅱ和細胞凋亡的方式起作用的〔4〕。在臨床治療中重復(fù)使用蒽環(huán)類藥物會導(dǎo)致頑固性心律失常，心臟擴大，頑固性心力衰竭，傳統(tǒng)的抗心衰治療往往無效，嚴重地影響到腫瘤患者的5年生存率和生活質(zhì)量，從而限制了蒽環(huán)類藥物在臨床的廣泛使用。

姜黃素是植物姜黃提取的酚類化合物，經(jīng)常被用作調(diào)味品及食物染色劑，研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗炎抗氧化作用〔5〕，同時姜黃素具有抗腫瘤作用，可使癌細胞凋亡。阿霉素具有強大的誘生自由基作用，通過電子與氧分子結(jié)合形成活性氧，減少NADH脫氫酶，形成半鯤結(jié)構(gòu)化合物，促使心肌線粒體氧化還原反應(yīng)，正常情況下，人體可以通過超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)、谷胱甘肽還原酶(GR)和GSH及時清除或還原自由基及其超氧化物，這些酶在清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化中具有重要作用。而阿霉素可使這些酶減少，活性降低〔6〕。GSH通過一些酶系抑制脂質(zhì)過氧化作用的啟動和終止脂質(zhì)過氧化的發(fā)展，從而阻斷新自由基的產(chǎn)生。姜黃素聯(lián)合谷胱甘肽干預(yù)大鼠阿霉素心肌損傷具有顯著作用，線粒體變性可能是阿霉素心肌損害的始動因素，有待于進一步研究。

有研究表明阿霉素心肌毒性早期引起線粒體超氧化反應(yīng)和其他活性氧的產(chǎn)生，通過一系列氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生NO和活性氮，隨后引起NF-κB和誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達增加〔7〕，阿霉素還可通過上調(diào)氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子如p53和NF-κB，改變了心肌線粒體通透性，增加心肌細胞凋亡，最終引起心臟毒性。在本實驗中說明阿霉素引起NF-k表達增加，NF-κB是由p50和p65亞基組成的異源二聚體，正常情況下它在胞質(zhì)中與其抑制蛋白IκB結(jié)合而呈非活性狀態(tài)。當(dāng)細胞受到各種刺激原作用時，NF-κB與其抑制蛋白IκB解離而激活，進入細胞核內(nèi)與特定基因啟動子結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因表達。近年研究發(fā)現(xiàn)，iNOS基因5'端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域中含有NF-κB結(jié)合位點，NF-κB激活參與iNOS mRNA表達〔8〕，iNOS和NO過氧化反應(yīng)是阿霉素心臟毒性及心肌細胞凋亡的觸發(fā)點和介質(zhì)，當(dāng)細胞受到各種刺激后，NF-κB即被活化，并很快異位到核與靶基因啟動子區(qū)域κB基序結(jié)合，啟動基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白合成，調(diào)節(jié)基因的表達。徐浩等〔9〕研究表明，NF-κB在阿霉素致大鼠心肌組織細胞損傷過程中起促進細胞凋亡的作用，可能與其調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因p53的表達有關(guān)。Buhrmann等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的跟腱細胞感染模型中，姜黃素能通過抑制IκBα磷酸化及降解，抑制在IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB激活。本研究結(jié)果顯示，在正常大鼠心肌組織中NF-κB有少量表達，可能是正常心肌組織NF-κB維持正常的心肌生理功能，調(diào)節(jié)正常心肌組織。姜黃素、谷胱甘肽對人體沒有毒性作用，可以用來保護惡性腫瘤病人在應(yīng)用阿霉素化療時，減輕心臟損害。

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