王遠征 王淑敏(解放軍第205醫(yī)院，遼寧 錦州 2000)

血紅素加氧酶(HO)是機體代謝血紅素的限速酶，參與許多代謝反應并發(fā)揮重要作用，以往研究發(fā)現(xiàn)其間接抑制缺血再灌、器官移植炎性反應起保護機體作用。糖尿病發(fā)生腎臟損害是一個漫長的過程，HO是否參與了機體代償并在其中扮演什么角色。體外實驗發(fā)現(xiàn)氯高鐵血紅素(Hemin)和鋅原卟啉(Znpp)能特異地誘導和抑制HO-1且適量濃度不會引起機體損傷〔1〕，本實驗建立2型糖尿病大鼠模型并用上述藥物干預，觀察HO-1血清學改變、腎臟表達及對腎臟損害的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 Hemin、STZ、Znpp(Sigma);HO-1、ELISA(Stressgen);Nrf-2(Santa Cruz)二抗(中杉金橋)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒、考馬斯亮藍(南京建成)，血糖儀(羅氏)，設備提供(遼寧醫(yī)學院科技中心)。

1.2 動物 健康8周齡SD大鼠40只，雌雄各半，體重(200±20)g，遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供(合格證SCXK)，按照國家實驗動物飼養(yǎng)和使用指南，飼養(yǎng)于光照周期10～12 h，25℃恒溫，大鼠自由進食水。

1.3 模型制備與實驗分組 適應性飼養(yǎng)1 w后，隨機選取10只設為正常對照，常規(guī)飲食，選擇40只高糖高脂高膽固醇飲食8 w(參照文獻方法〔2〕)，一次性腹腔注射30 mg/kg(STZ溶于0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液，pH4.4)，正常組注射等量生理鹽水(0.9%NaCl)72 h后剪尾取血測血糖，選擇血糖值 ＞16.7 mmol/L的30只大鼠納入標準。分為(A)正常組10只、(B)2型糖尿病組10只、(C)2型糖尿病+Hemin(15 mg/kg)組10只、(D)2型糖尿病+Znpp(10 μmol/L)組10只，成模后3 d給藥，均隔日一次腹腔注射共4 w。

1.4 標本收集 12 w時2.5%水合氯醛麻醉處死大鼠，股動脈取血離心血清備用，分離腎臟凍存于－80℃待測指標。

1.5 Western印跡 分離腎臟加入裂解液，考馬斯亮藍法提取蛋白并定量，SDS-PAGE電泳，取出膠放入Transfer buffer轉至PVDF膜(15V轉印15～30 min)，0.01 mol/L PBS洗膜、包被，一抗兔抗Nrf-2(1∶500)、兔抗HO-1(1∶1000)，二抗(山羊抗兔)按說明書操作，顯色液均勻滴在PVDF膜上顯色，夾起PVDF膜終止反應，全自動凝膠成像分析系統(tǒng)處理。

1.6 血清HO-1含量、活性檢測 根據(jù)血紅素加氧酶降解血紅素生成膽紅素和CO的原理，以反應物中膽紅素生成量計算HO-1活性。取血清按照文獻方法用分光光度計測OD值，計算膽紅素單位時間生成量，單位 nmol·mg－1·h－1。ELISA法測定血清HO-1蛋白，按照試劑盒說明操作。

1.7 腎臟線粒體MDA、SOD測定 利用MDA可與硫代巴比妥酸生成紅色產物在532 nm處最大吸收峰值原理測MDA;SOD抑制超氧陰離子產物顯色反應，通過抑制率計算SOD。腎組織低溫勻漿4℃離心留取上清液，考馬斯亮藍提取蛋白，595 nm處計算OD值，計算蛋白含量，并測定MDA、SOD，方法按照試劑盒操作。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較采用方差分析，兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 血清HO-1活性和含量測定 見表1。B組明顯低于A組(P＜0.05)，C、D組較B組明顯提高(P＜0.05)。

2.2 腎臟HO-1蛋白表達 各組HO-1均有表達，OD值計算B組較A組低，C組高于B組、A組，而D組低于B組。見表1。

2.3 腎皮質SOD、MDA測定 見表2。

表1 各組血清HO-1含量和活性的測定(±s，n=10)

表1 各組血清HO-1含量和活性的測定(±s，n=10)

與A組比較:1)P＜0.05;與B組比較:2)P＜0.05，下表同

組別HO-1含量(ng/ml)HO-1活性(nmol·mg－1·h －1)A組19.481±0.5125.8±0.097 B組 14.485±0.2031) 2.526±0.0511)C組 60.701±0.3552) 21.952±1.1032)D組 9.024±0.7172) 1.059±0.0422)

表2 各組腎皮質SOD、MDA變化(±s，n=10)

表2 各組腎皮質SOD、MDA變化(±s，n=10)

組別 SOD MDA(nmol/mg)A組7±0.9092.101±0.422 B組 3.906±0.431) 2.409±0.4271)C組 10.6±0.5332) 2.297±0.5112)D組 2.559±0.3582) 3.171±0.9172)

圖1 各組腎臟HO-1表達

3 討論

糖尿病腎臟損害包括腎小球硬化、腎小管上皮細胞變性、乳頭壞死等，臨床早期檢測24 h尿蛋白排泄率有助于發(fā)現(xiàn)腎臟損害，但這項指標病程短的患者容易忽略，以至于病程較長的患者出現(xiàn)腎臟損害已進展加重。動物實驗發(fā)現(xiàn)糖尿病早期就有腎臟的改變(這基于動物與人體的差異)腎臟體積增大、基底膜樣物質增多、腎小管變性、系膜增生、結節(jié)型硬化，目前控制血糖外缺乏有效地治療手段。但可以早期干預腎臟基質增生、纖維化的機制延緩糖尿病腎臟損害。

本文發(fā)現(xiàn)血糖升高大鼠體內血清HO-1會降低，而抗氧化能力也會降低。HO是代謝血紅素的限速酶，Hb代謝產生的血紅素誘導 HO-1釋放，能分解血紅素產生膽綠素、鐵、CO。HO-1能降低氧化應激的損傷物質MDA，并能使抗氧化物質SOD升高。核因子相關因子2(Nrf-2)及其抗炎元件在抗氧化應激中有重要作用。ROS會誘導Nrf-2轉入核內，使多種抗氧化酶表達升高其中包括HO-1。而體外研究發(fā)現(xiàn)高糖會誘導細胞HO-1表達和活性都升高，但隨著高糖作用的時間延長，其表達和活性會下降，一定程度上說明HO-1是種應激蛋白，參與機體損傷早期的代償〔3，4〕。本文觀察到HO-1在糖尿病大鼠會受到抑制，而且氧化應激損傷物質MDA升高，抗氧化SOD下降，于此Nrf-2表達受抑制，可能與HO-1在慢性病的抗氧化作用減弱有關。對冠心病、動脈粥樣硬化等慢性病的研究中，HO-1的表達會被抑制，其代謝產物〔5〕與研究一致。本研究對糖尿病大鼠12 w時循環(huán)HO-1含量和活性的測定發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠較正常大鼠會表達降低，而血糖維持在較高水平，說明了長期高糖會抑制HO-1表達和活性，而腎臟SOD和MDA的測定則顯示糖尿病時大鼠氧化應激明顯增強。

我們觀察到糖尿病會使HO-1受到抑制，而抑制HO-1活性也會使大鼠血糖升高，而有研究發(fā)現(xiàn)誘導HO-1增加并會改善胰島素抵抗〔6〕，HO-1會調節(jié)血糖是否與其刺激胰島素受體表達有待進一步研究。Hemin會上調HO-1水平但MDA并沒有升高反而降低，Nrf-2蛋白也表達增強，Znpp有相反的作用。這是利用產物誘導酶表達的原理，機體內源性產生的大量血紅素會損傷組織和器官，而外源性一定時間給予一定量的Hemin會誘導HO-1表達增高，且作用特異不會損傷機體〔7〕，與我們的實驗一致。誘導劑和抑制劑干預后的糖尿病大鼠可見其循環(huán)HO-1活性和含量的變化，并且Nrf-2改變也很明顯，以往研究發(fā)現(xiàn)核相關因子會促進HO-1表達，顯然HO-1受多種核轉錄因子影響，改變HO-1會影響Nrf-2水平，是否有反饋機制參與有待進一步研究。Nrf-2在Znpp組表達受抑制而抗氧化應激產物SOD也下降，說明Nrf-2受HO-1影響降低，Nrf-2不足會降低抗氧化水平，與實驗〔8〕一致。我們觀察到糖尿病會使HO-1受到抑制，而抑制HO-1活性也會使大鼠血糖升高，而有研究發(fā)現(xiàn)誘導HO-1增加并會改善胰島素抵抗〔6〕。抑制HO-1會升高血糖、抑制SOD并使MDA水平升高，加重腎臟的過氧化損傷線粒體和DNA，增加細胞損傷、基質滲出、腎小球纖維化進一步是腎小球硬化。HO-1會調節(jié)血糖是否與其刺激胰島素受體表達有待進一步研究對HO-1涉及的分子機制研究發(fā)現(xiàn)〔9〕，其參與了p38MAPK信號通路，總之對糖尿病治療的研究提供了更廣闊的道路。

1 Motterlini R，F(xiàn)oresti R，Intaglietta M.NO-mediated activation of heme oxygenase-endogenous cytoprotection against oxidative stress to endothelium〔J〕.Am J Physiol，1996;39:H107.

2 蔣朝暉，呂玉晶.高脂高糖飲食結合鏈脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型的改良〔J〕.中國比較醫(yī)學雜志，2011;21(1):33-5.

3 易善紅，葉 鋼.HO-1在EPO保護小鼠腎缺血再灌注損傷中的作用〔J〕.重慶醫(yī)科大學學報，2009;(9):1151-3.

4 邢邯英，黃 黛，野戰(zhàn)鷹.不同HO-1表達水平對糖尿病模型大鼠血管舒張功能和 NOS的影響〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(23):3061-3.

5 Li M，Kim DH，Tsenovoy PL.Treatment of obese diabetic mice with a heme oxygenase inducer reduces visceral and subcutaneous adiposity，increase adiponectin levels，and improves insulin sensitivity and glucose tolerance〔J〕.Diabetes，2008;57(6):1526-35.

6 Sheng WS，Hu S，Nettles AR.Hemin inhibits NO production by IL-1-stimulated human astrocytes through induction of home oxygenase-1 and reduction of p38 MAPK activation〔J〕.J Neuroinflammation，2010;7:51，1-10.

7 Kappas A，Drummond GS，Valaes T.A single dose of Sn-Mesoporphyrin prevents development of severe hyperbilirubinemia in glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns〔J〕.Pediatrics，2001;108(1):25-30.

8 Turkseven S，Kruger A，Mingone CJ.Antioxidant mechanism of home oxygenase-1 involves an increase in superoxide dismutase and catalase in experimental diabetes〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005;289(2):H701-7.

9 Ndisang JF，Jadhav JF.Up-regulating the hemeoxygenase system enhance insulin sensitivity and improve glucose metabolism in insulin-resistant diabetes in Goto-Kakizaki rats〔J〕.Endocrinology，2009;150(6):2627-36.