盛延良 江旭東 羅文哲 盧鳳美 孟慶媛 朱貴明 (佳木斯大學(xué)司法鑒定中心，黑龍江 佳木斯 154007)

硒蛋白是一類含有硒代半胱氨酸(Sec)的特殊蛋白質(zhì)。在抗氧化、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等方面都具有顯著的作用〔1～3〕;另一方面，硒蛋白的生物合成非常特殊，因?yàn)槲腚装彼岬木幋a密碼子(UGA)恰恰就是正常情況下的終止密碼子，其解碼需要一系列復(fù)雜的反式作用因子以及順式作用元件的相互作用才得以完成，而這種翻譯效率仍然較低〔4，5〕。因此，深入研究各種反式作用因子以及順式作用元件的作用機(jī)制具有重要的意義。硒半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白(SBP)2是一個(gè)多功能蛋白，屬于L7Ae家族，SBP2蛋白C端含有RNA結(jié)合基序和核糖體結(jié)合基序，是Sec插入序列(SECIS)特異性結(jié)合蛋白，能與目前檢測(cè)到的所有Ⅰ型和Ⅱ型SECIS的G-A/A-G四聯(lián)體堿基對(duì)形成的Kink-turn基序相結(jié)合〔6，7〕。為了深入研究SBP2在UGA解碼中的作用以及提高硒蛋白的基因工程表達(dá)效率，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了SBP2基因的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物293T細(xì)胞中進(jìn)行初步表達(dá)分析，并考察該基因的超表達(dá)對(duì)硒蛋白P轉(zhuǎn)錄水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌株(DH5α)、293T細(xì)胞、質(zhì)粒pcDNA3.1(+)和質(zhì)粒pCMV-XL4-SBP2為本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、RT-PCR試劑盒等均購于寶生物工程(大連)有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒等均購于天根生化科技(北京)有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基、血清、培養(yǎng)皿等為 Hyclone產(chǎn)品。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 SBP2基因克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+) 用EcoRI和XbaI雙酶切將目的基因SBP2編碼區(qū)(2565 bp)連同其3'非編碼序列(約830 bp)從其保存質(zhì)粒pCMV-XL4-SBP2中一起切割下來，同時(shí)載體pcDNA3.1(+)也進(jìn)行同樣的雙酶切，酶切產(chǎn)物使用回收試劑盒回收后，再用DNA連接酶于16℃進(jìn)行過夜連接，次日取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，利用質(zhì)粒電泳、酶切及測(cè)序等方法篩選和鑒定重組質(zhì)粒的陽性克隆，進(jìn)而獲得正確的表達(dá)載體pcDNA3.1-SBP2。

1.2.2 pcDNA3.1-SBP2轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞及其表達(dá)分析 在完成pcDNA3.1-SBP2質(zhì)粒構(gòu)建后，為了檢驗(yàn)該表達(dá)質(zhì)粒的有效性，采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，同時(shí)以帶有綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒pcDNA3.1-GFP(為本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建)作為對(duì)照。為了考察硒對(duì)基因表達(dá)的影響，設(shè)置另一轉(zhuǎn)染組，添加100 nmol/L無機(jī)硒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在轉(zhuǎn)染后第3日收集細(xì)胞，提取總RNA，并以RT-PCR方法檢測(cè)SBP2基因表達(dá)情況。PCR所用引物，正義:Sbg-s 5'AGGAACCACCAGTGACAGAGCAG 3'，反義:Sbg-a 5'GATTTCCTGTCTGTTCGCTTATGG 3'。PCR 擴(kuò)增時(shí)退火溫度為60℃，延伸45 s，循環(huán)30次。為了準(zhǔn)確反映基因表達(dá)的變化，使用內(nèi)參β-actin作為RT-PCR對(duì)照。

1.2.3 SBP2超表達(dá)對(duì)硒蛋白P表達(dá)的影響 為了考察SBP2超表達(dá)對(duì)硒蛋白P表達(dá)的影響，針對(duì)人硒蛋白P基因設(shè)計(jì)了一對(duì)檢測(cè)引物，正義:Seg-s5'TGCGAGTAAAACTGAAGAAAGAAGG 3'，反義:Seg-a 5'CAGGATGAGTAGGAGCATTTGGTG 3'。PCR擴(kuò)增時(shí)退火溫度為58℃，延伸30 s，循環(huán)30次。同時(shí)使用內(nèi)參β-actin作為RT-PCR對(duì)照，因?yàn)閮?nèi)參引物的退火溫度與硒蛋白P檢測(cè)引物的退火溫度相近，所以將二者置于同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建SBP2基因的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA3.1-SBP2 應(yīng)用RT-PCR方法比較容易就可以將目的DNA片段擴(kuò)增出來，如圖1所示，目的條帶大小符合預(yù)期。PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化、雙酶切并連入pcDNA3.1(+)載體，經(jīng)過篩選和酶切鑒定獲得陽性重組克隆。最終經(jīng)測(cè)序鑒定證實(shí)目的基因并沒有發(fā)生突變。見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后SBP2T基因的表達(dá)及其對(duì)硒蛋白P的影響 將pcDNA3.1-SBP2表達(dá)質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)利用pcDNA3.1-GFP質(zhì)粒進(jìn)行對(duì)照，其綠色熒光可比較準(zhǔn)確地反映轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后第2天觀察細(xì)胞，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功。轉(zhuǎn)染后第3天收集細(xì)胞提取總RNA做RT-PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明pcDNA3.1-SBP2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞中SBP2基因?qū)崿F(xiàn)了超表達(dá)。說明該表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建是成功的。另外，培養(yǎng)的細(xì)胞添加硒后對(duì)SBP2基因的轉(zhuǎn)錄水平有明顯的影響。SBP2對(duì)硒蛋白的轉(zhuǎn)錄水平有顯著的影響，同時(shí)添加硒后，硒蛋白的轉(zhuǎn)錄顯著增加。見圖2～圖4。

圖1 pcDNA3.1-SBP2表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

圖2 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

圖3 轉(zhuǎn)染后RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 硒蛋白P的RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

已有研究比較明確地證實(shí)了SBP2在硒蛋白的翻譯中具有重要作用，但很多具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究〔8〕。本研究考察了在轉(zhuǎn)錄水平，SBP2在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中超表達(dá)后能否引起硒蛋白表達(dá)的提高。因?yàn)槲鞍譖在哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的20多種硒蛋白中最具有代表性，除了類似于其他硒蛋白具有的抗氧化等功能外，還有轉(zhuǎn)運(yùn)硒的作用(硒蛋白P含有10個(gè)硒半胱氨酸，而其他硒蛋白均只含1個(gè))〔9〕，所以利用硒蛋白P來考察硒蛋白的合成很合適。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著SBP2的超表達(dá)，硒蛋白P的轉(zhuǎn)錄水平也顯著提高。當(dāng)然這還不能確定硒蛋白的翻譯是否受到影響。SBP2的超表達(dá)如何影響硒蛋白翻譯水平還需要另作研究。另外，本研究再次證實(shí)了不添加硒的情況下，培養(yǎng)的細(xì)胞中硒蛋白P的轉(zhuǎn)錄水平是很低的，而在添加硒后，硒蛋白P的轉(zhuǎn)錄水平提高，這充分說明了其對(duì)硒蛋白表達(dá)調(diào)控的作用〔10〕。

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4 Small-Howard A，Morozova N，Stoytcheva Z，et al.Supramolecular complexes mediate selenocysteine incorporation in vivo〔J〕.Mol Cell Biol，2006;26(6):2337-46.

5 Jesus L A，Hoffmann PR，Michaud T，et al.Nuclear assembly of UGA decoding complexes on selenoprotein mRNAs:a mechanism for eluding nonsense-mediated decay〔J〕?Mol Cell Biol，2006;26(5):1795-805.

6 Sillers LC，Gonc N，Liao XH，et al.Selenoprotein deficiency syndrome caused by novel heterozygous mutations in the SBP2 gene〔J〕.Endocr Rev，2012;33:590.

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8 Chavatte L，Brown BA，Driscoll DM.Ribosomal protein L30 is a component of the UGA-selenocysteine recoding machinery in eukaryotes〔J〕.Nat Struct Mol Biol，2005;12(5):389-90.

9 Burk RF，Hill KE.Selenoprotein P-expression，functions，and roles in mammals〔J〕.Biochim Biophys Acta，2009;1790(11):1441-7.

10 Reszka E，Gromadzinska J，Stanczyk M，et al.Effect of selenium on expression of selenoproteins in mouse fibrosarcoma cells〔J〕.Biol Trace Elem Res，2005;104(2):165-72.