秦文波 遲寶進(jìn) 姜大力 何昊麟 陳大印 張 鵬 李加彬

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，黑龍江 佳木斯 154002)

全球約有1億多勃起功能障礙(ED)患者，在40～70歲的男性中，約有52%的男性有不同程度的ED〔1〕。糖尿病、心血管疾病、抑郁癥等是勃起功能障礙的重要危險(xiǎn)因素〔2～4〕，其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚未完全清楚，也缺少理想的治療手段。因此，本實(shí)驗(yàn)主要探討2型糖尿病(T2DM)大鼠陰莖海綿體鈣敏感受體(CaSR)變化。

1 材料與方法

1.1 T2DM型ED動(dòng)物模型的建立 選用雄性Wistar大鼠50只，體重150～200 g，動(dòng)物及飼料由佳木斯大學(xué)動(dòng)物室提供。經(jīng)檢測(cè)每只大鼠性功能均正常，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)取10只為正常對(duì)照組，余40只給予高糖高脂飲食4 w后，禁食8 h，按25 mg/kg一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ)，復(fù)制T2DM動(dòng)物模型，第4天割尾取血檢測(cè)外周血血糖，血糖 ＞16.67 mmol/L，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿，體重減輕即確定 DM模型復(fù)制成功。注射STZ4 w后，將T2DM大鼠分組放在玻璃罐中，然后在大鼠頸部皮下注射阿撲嗎啡 80 μg/kg，觀察60 min，在此期間記錄陰莖有無(wú)勃起，陰莖無(wú)勃起大鼠為成功成模。將造模成功大鼠隨機(jī)分成三組:T2DM模型組，胰島素治療組，葉酸治療組。

1.2 ED實(shí)驗(yàn) 分別于4 w和8 w兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行ED實(shí)驗(yàn)，每只大鼠在頸項(xiàng)背部皮下注射阿撲嗎啡100 μg/kg。每只注射后觀察60 min，并予以記錄陰莖有無(wú)勃起和有無(wú)打呵欠。龜頭充血或陰莖體勃起成角大于90度為勃起1次。

1.3 血中總同型半胱氨酸含量(Hcy)測(cè)定 各組大鼠于16 w后，尾靜脈采血，分離血漿，采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定血中 Hcy含量。

1.4 激光共聚焦檢測(cè)(LSCM)陰莖海綿體CaSR的表達(dá)情況解剖顯微鏡下仔細(xì)分離大鼠陰莖，獲得陰莖球海綿體平滑肌。常規(guī)制備石蠟切片(3 μm)，將玻片放入60℃烤箱中，烤干備用。將玻片烘干，抗原修復(fù)，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，4℃冰箱過(guò)夜加上山羊抗兔FITC熒光二抗(稀釋度1∶50)，加上PI做細(xì)胞核的熒光標(biāo)記(稀釋度1∶1000)。用甘油進(jìn)行封片，在激光共聚焦顯微鏡下拍照，各組隨機(jī)選取2個(gè)部位，用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量積分光密度(IOD)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析SNK-q檢驗(yàn)，χ2及Fisher精確概率法。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清胰島素、血漿Hcy濃度、陰莖勃起次數(shù) 與正常對(duì)照組相比，T2DM模型組大鼠血清胰島素、血漿Hcy濃度明顯升高(P＜0.05);T2DM模型組大鼠陰莖勃起次數(shù)明顯減少(P＜0.05)。與T2DM模型組相比，胰島素治療組和葉酸治療組大鼠血清胰島素、血漿Hcy濃度明顯降低(P＜0.05);治療后二組大鼠陰莖勃起次數(shù)明顯增加(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 大鼠血清胰島素、血漿Hcy濃度、陰莖勃起次數(shù)比較(n=10，±s)

表1 大鼠血清胰島素、血漿Hcy濃度、陰莖勃起次數(shù)比較(n=10，±s)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.05，與T2DM模型組比較:2)P＜0.05

陰莖勃22.72±1.688.67±2.091.93±0.71 T2DM模型組 51.60±3.461)23.91±2.311) 0.17±0.111)胰島素治療組 24.94±1.112)18.05±0.482) 0.32±0.632)葉酸治療組 23.48±1.622)17.69±1.272) 0.29±0.612)起次數(shù)正常對(duì)照組分組 胰島素(mmol/L)Hcy(μmol/L)

2.2 大鼠陰莖海綿體平滑肌CaSR的表達(dá) T2DM模型組和葉酸治療組大鼠的海綿體平滑肌中 CaSR表達(dá)〔(51896±8643)和(4269±6937)〕與正常對(duì)照組〔(34524±4985)〕比較均明顯增多(P＜0.05)，胰島素治療組(40636±9957)CaSR表達(dá)明顯少于T2DM模型組(P＜0.05)，與葉酸治療組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖1)。

圖1 各組大鼠陰莖海綿體CaSR表達(dá)

3 討論

T2DM早期多無(wú)胰島β細(xì)胞功能減損，因此患者血清胰島素水平接近正?；蚱?，但血中胰島素不能有效地控制血糖水平，表現(xiàn)為糖耐量異常;患者常出現(xiàn)靶組織對(duì)胰島素反應(yīng)不敏感甚至出現(xiàn)胰島素抵抗的臨床狀態(tài);T2DM患者常伴有肥胖、高血壓、血脂異常，這些因素恰是心血管疾病的高危因素。在實(shí)驗(yàn)中選用Wistar大鼠建立T2DM動(dòng)物模型，先通過(guò)尾靜脈注射STZ造成糖耐量異常，再喂以高熱量飲食誘發(fā)動(dòng)物肥胖，持續(xù)喂養(yǎng)10 w后檢測(cè)血清胰島素水平升高，這與人的T2DM理生理改變相類似。此方法與實(shí)驗(yàn)性糖尿病動(dòng)物模型建立的相關(guān)研究一致〔5，6〕，在研究T2DM方面已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用。

研究表明高蛋白，高糖飲食可以引起高Hcy血癥。而高Hcy是心血管疾病的獨(dú)立致病因素之一。Hcy能使細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基具有細(xì)胞毒性作用，并可以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增生，使血管硬化，促使內(nèi)皮小血栓形成。誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬低密度脂蛋白，加重粥樣硬化。而作為動(dòng)脈系統(tǒng)終末部分的海綿體動(dòng)脈同樣也會(huì)受累，進(jìn)而導(dǎo)致ED〔7〕，這就說(shuō)明高Hcy對(duì)心血管的致病作用也是ED的致病因素之一。經(jīng)過(guò)阿撲嗎啡試驗(yàn)而證明模型組大鼠陰莖勃起次數(shù)明顯減少。即血漿Hcy濃度增高，大鼠陰莖勃起功能下降。前期研究證明〔8〕，電鏡顯示睪丸精原細(xì)胞線粒體呈空泡樣變，嵴結(jié)構(gòu)模糊甚至消失，線粒體的這些改變使其正常供能受到破壞，從而使精子發(fā)生終止于精母細(xì)胞和精子細(xì)胞階段，導(dǎo)致管腔內(nèi)精子數(shù)量明顯減少。附睪主細(xì)胞表面絨毛脫落，腔內(nèi)精子數(shù)量減少及光鏡下陰莖平滑肌細(xì)胞數(shù)量減少，纖維結(jié)締組織密度增加均表明糖尿病時(shí)，睪丸、附睪及陰莖的病理改變可能是造成生精功能障礙及ED的原因。

本研究采用LSCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型組CaSR蛋白表達(dá)明顯增加，提示CaSR的表達(dá)增加參與了ED的發(fā)生。CaSR是G蛋白耦聯(lián)受體的C家族成員。CaSR主要分布在參與鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的甲狀旁腺、腎腸道、骨組織和腎組織以及其他細(xì)胞(中樞和外周神經(jīng)、肝臟、血細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞等)，其功能主要是維持Ca2+和其他金屬離子穩(wěn)態(tài)，尚可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、離子通道開(kāi)啟、激素分泌等。CaSR的配體主要是細(xì)胞外 Ca2+，Mg2+、Gd3+、新霉素、精胺等多價(jià)陽(yáng)離子亦是CaSR的激動(dòng)劑。CaSR可通過(guò)激活MAPKs(包括p38 MAPK，JNK和ERK)-細(xì)胞色素C-Caspase-3通路及 Fas受體死亡通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔9，10〕。前期研究還表明，NO和CO系統(tǒng)與鈣通道相關(guān)性在ED發(fā)生發(fā)展中的作用〔11～13〕，本研究發(fā)現(xiàn)CaSR在大鼠陰莖海綿體平滑肌有表達(dá)，且在T2DM大鼠，陰莖海綿體平滑肌CaSR的表達(dá)異常。

研究表明，ED時(shí)鈣庫(kù)操縱性陽(yáng)離子通道和受體操縱性陽(yáng)離子通道在陰莖動(dòng)脈平滑肌表達(dá)上調(diào)，可能是ED的一個(gè)新機(jī)制〔14，15〕。鑒于CaSR普遍在機(jī)體各系統(tǒng)、器官、組織和細(xì)胞中有表達(dá)，而且CaSR引起細(xì)胞內(nèi)鈣升高的機(jī)制也是通過(guò)鈣庫(kù)操縱性鈣通道(SOCC)和受體操縱性鈣通道(ROCC)，因此，推測(cè)CaSR在陰莖平滑肌細(xì)胞有功能表達(dá)，并可能參與ED的發(fā)生。

綜上，本研究首次證明了，大鼠陰莖海綿體平滑肌有CaSR表達(dá)，T2DM誘導(dǎo)的CaSR表達(dá)增加在T2DM血管病變中發(fā)揮重要的作用，這也可能是T2DM大鼠ED的原因之一，其機(jī)制與CaSR介導(dǎo)的Ca2+增加有關(guān)，具體作用機(jī)制和信號(hào)途徑有待于進(jìn)一步研究。

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