王 灃 王繼靈 操樂杰 徐修才 伍 權(quán)

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院呼吸科中心實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230001)

研究〔1～3〕表明酪氨酸蛋白激酶小分子抑制劑(TKIs)療效與表皮生長因子受體(EGFR)基因突變狀態(tài)關(guān)系密切，因此明確EGFR突變類型對(duì)選擇合適的患者進(jìn)行靶向治療十分必要。研究表明采用直接測(cè)序法可以對(duì)手術(shù)切除的腫瘤組織進(jìn)行全方位的EGFR基因分析，但作為“金標(biāo)準(zhǔn)”的直接測(cè)序法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求高，且耗時(shí)長，步驟繁瑣，費(fèi)用較高，靈敏度低。此外很多患者在診斷肺癌時(shí)已經(jīng)是疾病晚期，無法通過手術(shù)切除獲得足夠的腫瘤組織標(biāo)本。本研究采用基于PCR技術(shù)平臺(tái)靈敏度高的突變特異性擴(kuò)增系統(tǒng)(ARMS)法，對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者胸腔積液脫落細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)及氣管鏡活檢組織標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因突變分析，并探索檢測(cè)結(jié)果與靶向治療近期療效間的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2011年10月至2012年7月在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院呼吸科就診的、經(jīng)臨床和病理確診為NSCLC患者共34例，年齡28～82歲，平均63歲;男15例，女19例;吸煙11例，不吸煙23例;PS評(píng)分0～1分28例，2～4分6例;惡性胸腔積液22例，轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)5例和氣管鏡活檢組織標(biāo)本7例;肺腺癌30例，鱗癌4例。入組的患者有19例給予TKIs靶向治療，進(jìn)行EGFR-TKI治療前均進(jìn)行了頭顱增強(qiáng)MRI、胸部CT平掃、腹部B超和骨掃描檢查，均證實(shí)為Ⅵ期患者。

1.2 標(biāo)本處理 收集NSCLC患者經(jīng)胸腔穿刺后胸腔積液200 ～250 ml，室溫離心 15 min，2500 r/min，取離心管沉淀物1 ml，量少時(shí)用胸腔積液補(bǔ)足1 ml。經(jīng)離心后沉降下來的細(xì)胞團(tuán)，通過細(xì)胞學(xué)涂片、HE染色，光鏡下確定胸水中癌細(xì)胞。獲取近似100 mg的轉(zhuǎn)移性(N3)淋巴結(jié)和氣管鏡活檢組織標(biāo)本，采用4%中性甲醛溶液固定，在(－20±2)℃條件下保存、運(yùn)輸。

1.3 DNA提取 取先前準(zhǔn)備好的惡性胸腔積液脫落細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)和支氣管鏡活檢標(biāo)本，使用DNA提取試劑盒DNeasy Blood ＆ Tissue Kit(Qiagen，Hilden，Germany)提取 DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。所提DNA使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度。

1.4 EGFR基因突變檢測(cè) 根據(jù)廈門艾德EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作，所使用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀機(jī)型為ABI 7500。

1.5 評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) 在此次臨床試驗(yàn)中，對(duì)于非吸煙的患者定義為吸煙總數(shù)小于100支，肺癌的病理分型依據(jù)最新分類標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)國際聯(lián)盟對(duì)癌癥轉(zhuǎn)移的定義標(biāo)準(zhǔn)鑒別腫瘤的分期，療效評(píng)估根據(jù)RECIST指南，兩個(gè)月進(jìn)行一次TKI療效評(píng)估。臨床獲益率(CBR)=〔完全緩解(CR)+部分緩解(PR)+穩(wěn)定期(SD)〕/總例 ×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行Fisher確切概率法及非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征與EGFR基因突變間的關(guān)系 34例NSCLC患者EGFR基因突變率為56%(19/34)，發(fā)現(xiàn)19外顯子缺失15例，21外顯子點(diǎn)突變2例，19、21外顯子雙突變2例;不吸煙患者突變率高于吸煙患者(P＜0.05);腺癌組突變率高于鱗癌組(P＜0.05)。此外，EGFR突變狀態(tài)在不同年齡、性別及身體狀態(tài)評(píng)分組別中無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＞0.05)，見表1。

2.2 EGFR突變檢出率與樣本類型間的關(guān)系 胸腔積液脫落細(xì)胞、淋巴結(jié)及氣管鏡活檢標(biāo)本中突變陽性突變檢出率分別為59%、60%、43%，不同類型標(biāo)本間ERGR突變均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。組織學(xué)標(biāo)本EGFR陽性者DNA濃度〔102(52，274)mg/L〕高于 EGFR 陰性者〔72(45，194)mg/L，Z= －0.80，P=0.42〕。細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中EGFR突變陽性和突變陰性組患者DNA濃度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔41(39，120)vs 58(39，65)mg/L，Z= －0.10，P=0.92〕。

2.3 EGFR突變狀態(tài)和TKIs療效間的關(guān)系 19例患者得到TKIs(吉非替尼、?？颂婺?治療。突變組和野生型組CBR分別為93%(CR 0例，PR 8例，SD 5例)和20%(CR 0例，PR 0例，SD 1例)，二者差異顯著(P=0.006)。

表1 EGFR基因突變與臨床特征的相關(guān)性(n)

3 討論

盡管肺癌診斷、分期、治療日趨規(guī)范化，由于缺乏有效地早期篩查制度和方法，患者總體預(yù)后依然很差，5年生存率僅16%〔4〕。自2004年EGFR基因活性突變被發(fā)現(xiàn)以來，針對(duì)這一靶點(diǎn)的個(gè)體化治療使NSCLC患者的生存期和生活質(zhì)量明顯提高。研究發(fā)現(xiàn)EGFR是原癌基因c-erbB1的表達(dá)產(chǎn)物，參與腫瘤的生長、侵襲等過程〔5〕。肺癌體細(xì)胞EGFR基因突變狀態(tài)與NSCLC患者分子靶向治療是否獲益有關(guān)，突變陽性的患者對(duì)EGFR-TKIs尤其敏感，然而野生型的患者幾乎不能獲益〔1～3〕?？梢娺M(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)對(duì)選擇合適人群進(jìn)行靶向治療十分必要。

當(dāng)前EGFR基因檢測(cè)方法眾多，除局限性較多的“金標(biāo)準(zhǔn)”直接測(cè)序法外，ARMS法受到廣泛推崇。它具有高特異性和高靈敏度〔6〕的優(yōu)點(diǎn)，1/100的突變型DNA都可以檢出，已成為較成熟的檢測(cè)EGFR突變方法。本文與先前的研究已經(jīng)證實(shí)在外科切除的亞裔腺癌患者中EGFR基因突變率在55%左右〔7〕。肺腺癌、非吸煙組突變率顯著高于鱗癌、吸煙患者，鱗癌組并未發(fā)現(xiàn)突變，這可能與本研究的樣本量小、入組的多為腺癌患者，且鱗癌的發(fā)生EGFR基因突變率低有關(guān)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)非腺癌患者僅10%發(fā)生EGFR突變〔8〕。值得關(guān)注的是惡性胸腔積液患者，突變陽性率較高的原因一方面可能與入組的患者多為女性、非吸煙、肺腺癌等高選擇性易于發(fā)生EGFR基因突變?nèi)巳河嘘P(guān)。此外，先前文獻(xiàn)〔9〕表明惡性胸腔積液標(biāo)本中EGFR突變檢出陽性率較高，可能與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)促進(jìn)胸膜轉(zhuǎn)移有關(guān)〔10〕，而表皮生長因子信號(hào)通路可能導(dǎo)致VEGF在癌細(xì)胞中過度表達(dá)〔11〕。

晚期肺癌患者胸膜轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均很常見，約7%～15%的肺癌患者疾病發(fā)展過程中并發(fā)惡性胸腔積液〔12〕，尤其肺腺癌患者更多見。本研究通過操作方便、創(chuàng)傷較小的纖維支氣管鏡、淋巴結(jié)活檢及胸腔穿刺引流技術(shù)獲取微小組織及細(xì)胞標(biāo)本，確認(rèn)了轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)、氣管鏡活檢微量組織標(biāo)本和胸水脫落細(xì)胞標(biāo)本中應(yīng)用ARMS法檢測(cè)EGFR基因突變的可行性，突變檢出成功率達(dá)100%。孫孟紅等〔13〕發(fā)現(xiàn)隨獲取組織樣本塊的減小，EGFR突變檢出率有下降趨勢(shì)，大標(biāo)本突變檢出率高于中、小標(biāo)本，特別是細(xì)胞學(xué)標(biāo)本明顯低于大標(biāo)本，并解釋為小標(biāo)本所含腫瘤細(xì)胞量少，而直接測(cè)序法敏感性不高導(dǎo)致漏檢所致。本研究表明靈敏度高的ARMS法適合于微小組織樣本及細(xì)胞DNA標(biāo)本，較直接測(cè)序法更敏感，適用標(biāo)本范圍更廣。

近年肺癌異質(zhì)性倍受關(guān)注，Han等〔14，15〕研究表明肺癌原發(fā)病灶和胸腔積液及淋巴結(jié)之間EGFR基因突變存在不一致性。由于難以獲得腫瘤組織標(biāo)本，入組對(duì)象中僅對(duì)1例患者原發(fā)病灶的氣管鏡活檢標(biāo)本和轉(zhuǎn)移性胸腔積液、外周血血漿進(jìn)行配對(duì)檢測(cè)，其中氣管鏡活檢組織標(biāo)本和胸腔積液脫落細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果一致，均為19外顯子缺失;而外周血并未發(fā)現(xiàn)陽性突變，其原因有待于外周血與配對(duì)組織進(jìn)行EGFR基因檢測(cè)的大樣本研究。

綜上，在臨床無法獲得足量手術(shù)切除腫瘤組織標(biāo)本的情況下，ARMS法檢測(cè)氣管鏡活檢標(biāo)本及轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)、胸腔積液標(biāo)本是一種行之有效的分子基因檢測(cè)手段，EGFR基因突變的檢測(cè)結(jié)果可以指導(dǎo)TKIs治療選擇，為肺癌晚期需靶向治療的患者提供可靠的分子學(xué)依據(jù)，應(yīng)用價(jià)值廣闊。

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