王先國 陳景華 李 宇 張山燕 周 遠(yuǎn) (泰安市腫瘤防治院化療二科，山東 泰安 271000)

目前鉑類化療方案(即包含奧沙利鉑的FOLFOX方案)被認(rèn)為是化療的金標(biāo)準(zhǔn)，但是，許多大腸癌患者在接受鉑類化療后出現(xiàn)耐藥性，使得化療失敗〔1〕。乳腺癌敏感蛋白(BRCA)-1具有調(diào)控基因表達(dá)的作用，可對DNA進(jìn)行重組修復(fù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，從而能抑制腫瘤的發(fā)生，若其功能失活乳腺癌和卵巢癌的發(fā)病率將顯著提高。研究發(fā)現(xiàn)，BRCA-1和核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因(ERCC)1與鉑類化療耐藥性有很大的關(guān)聯(lián)性〔2〕。本研究旨在探討此兩種基因的表達(dá)與鉑類化療后患者各項(xiàng)生存指標(biāo)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 入選對象 選取我院2007年1月至2010年3月的大腸癌患者58例。所有患者進(jìn)行手術(shù)切除，已經(jīng)病理證實(shí)為大腸癌患者，所選對象中所有患者心、肝、腎功能均正常，未合并兩種及以上腫瘤，在術(shù)前均未接受過放療和化療，并且隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前接受過放、化療患者;哺乳期婦女、孕婦;有精神性疾病患者;兩種及以上腫瘤合并患者。58例大腸癌患者中，男38例(65.51%)、女20例(34.48%)，年齡38～82歲，中位年齡62歲。按照TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期6例，Ⅱ期32例，Ⅲ期20例。28例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，30例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1.2 研究方法 詳細(xì)記錄58例研究對象的姓名、性別、年齡、接受手術(shù)時(shí)間、病理類型及分期。通過電話隨訪，對患者的身體狀況、疾病復(fù)查狀況、疾病進(jìn)展?fàn)顩r、患者死亡原因及時(shí)間進(jìn)行詳細(xì)記錄。以患者死亡為結(jié)局，至隨訪截止仍存活者視為結(jié)尾數(shù)據(jù)。隨訪至2013年5月結(jié)束，隨訪總時(shí)間為70個(gè)月。

1.3 化療方案 應(yīng)用FOLFOX化療方案:奧沙利鉑(L-OHP)100 mg/m2，靜滴，第 1 天;亞葉酸鈣(CF)200 mg·m－2·d－1，在5-氟尿嘧啶(5-FU)前2 h靜滴，第1～2天;5-FU 400 mg/m2，靜脈注射，第1天，然后再用 2400 mg/m2，46 h持續(xù)靜滴，第1～2天;14 d后重復(fù)治療，共12個(gè)療程。

1.4 試劑 主要包括鼠抗人ERCC mRNA和鼠抗人BRCA-1單克隆抗體試劑盒以及SP試劑盒(即用型)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(內(nèi)含底物、顯色劑、緩沖液)，應(yīng)用試劑來自上海研域生物科技有限公司。

1.5 BRCA-1、ERCC mRNA檢測 使用快速免疫組化法對BRCA-1、ERCC mRNA進(jìn)行測定，組織切片取自入選的58例研究對象，實(shí)驗(yàn)過程如下:(1)用4%的甲醛對患者組織標(biāo)本進(jìn)行固定，制作石蠟切片，經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色后確診為大腸癌者制作成5 μm切片，置于載玻片上，經(jīng)烤片后使組織貼于載玻片上，然后對其脫蠟、水化(每例標(biāo)本均制作兩張玻片)。(2)用3%H2O2將玻片培育10 min后，再用蒸餾水按照每次2 min的方法沖洗3次。(3)在每例兩張載玻片上，分別滴加1滴BRCA-1、ERCC1單克隆抗體試劑(按1∶100稀釋)。(4)將載玻片室溫培育，20 min后滴加DAB顯色液。(5)蒸餾水沖洗10 min后，用蘇木精染色1 min，經(jīng)酒精分化后，再用氨水返藍(lán)。(6)用蒸餾水沖洗后，使用酒精梯度脫水。(7)二甲苯透明后使用中性樹脂將撥片封固。(8)將制好的玻片置于顯微鏡下找到癌細(xì)胞并觀察。

1.6 結(jié)果判斷 高倍鏡下觀察細(xì)胞核，若ERCC mRNA和BRCA-1陽性，則在鏡下細(xì)胞核中可以觀察到棕褐色或棕黃色顆粒沉著物，且此沉著物顏色較背景色明顯、細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。本實(shí)驗(yàn)以Fromowitz為評判標(biāo)準(zhǔn):(1)陽性細(xì)胞所占百分比:10個(gè)高倍鏡視野中，黃染的陽性細(xì)胞的總數(shù)與10個(gè)視野中所有細(xì)胞總和的百分比。細(xì)胞陽性數(shù)賦值方法，0分:＜5%;1分:5% ～25%;2分:26% ～50%;3分:51% ～75%;4分:＞75%。細(xì)胞著色強(qiáng)度賦值，0分:不著色 ;1分:淡黃色;2分:棕黃色;3分:棕褐色。(2)以細(xì)胞陽性得分與著色強(qiáng)度得分的乘積判斷細(xì)胞陽性水平，0～1分:陰性;＞2分:陽性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，運(yùn)用Pearson相關(guān)分析，應(yīng)用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存曲線估計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 BRCA-1實(shí)驗(yàn)結(jié)果 大腸癌組織切片顯示BRCA-1均有表達(dá)，其中BRCA-1陽性表達(dá)37例(63.8%)，陰性表達(dá)21例(36.2%)。不同的分化水平、臨床分期、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移與否與BRCA-1表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。BRCA-1陽性表達(dá)者平均生存期為(52.00±4.00)個(gè)月(95%CI:44.16～59.84)，中位生存期(MST)為48.35個(gè)月(95%CI:23.47～64.53);陰性表達(dá)者平均生存期為(40.86±3.04)個(gè)月(95%CI:34.89～46.82)，MST為 44.58個(gè)月(95%CI:38.24～55.77)。BRCA-1陽性與陰性者生存時(shí)間之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表 1，圖1。

2.2 ERCC mRNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果 大腸癌組織切片顯示ERCC mRNA均有表達(dá)，其中陽性表達(dá)25例(43.1%)，陰性表達(dá)33例(56.9%)。臨床分期、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移與否與ERCC mRNA表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ERCC mRNA陽性表達(dá)者平均生存期為(43.75±4.70)個(gè)月(95%CI:34.54～52.96)，MST為36.72個(gè)月(95%CI:33.24～47.18);陰性表達(dá)者平均生存期為(48.60±1.99)個(gè)月(95%CI:44.7～52.5)，MST為48.10個(gè)月(95%CI:47.12～48.88)。ERCC mRNA陽性與陰性者生存時(shí)間之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2，圖2。

2.3 BRCA-1、ERCC mRNA表達(dá)水平與生存時(shí)間相關(guān)性研究經(jīng)Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BRCA-1陽性表達(dá)及ERCC mRNA陰性表達(dá)與生存時(shí)間呈正相關(guān)性(r=0.651，0.579;均P＜0.01)，即BRCA-1和ERCC mRNA表達(dá)水平對經(jīng)鉑類治療后的患者生存時(shí)間均有影響。

表2 ERCC mRNA表達(dá)與大腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

圖2 不同ERCC mRNA表達(dá)患者的生存分析

3 討論

機(jī)體在維持基因表達(dá)的過程中，基因組的功能整體性、機(jī)體的抗癌過程以及對致癌基因的損傷性修復(fù)是極為重要的，而這些功能主要是通過核苷酸切除修復(fù)(NER)過程來實(shí)現(xiàn)。經(jīng)研究表明，癌癥患者經(jīng)鉑類治療的效果受DNA修復(fù)能力的影響，在NER過程中，ERCC1是一種極其關(guān)鍵的核苷酸內(nèi)切酶，并且是此過程的重要限速酶，在DNA損傷的識別功能和基因切割修復(fù)上起關(guān)鍵作用〔3〕。若ERCC1表達(dá)水平低或者無表達(dá)，就能導(dǎo)致細(xì)胞基因不穩(wěn)定，增加細(xì)胞的惡性程度，癌細(xì)胞易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。因此，許多學(xué)者將ERCC1認(rèn)為此基因可能是相關(guān)腫瘤患者的預(yù)后指標(biāo)〔4，5〕。BRCA1在基因的損傷修復(fù)過程中同樣起著重要作用，BRCA-1能夠調(diào)節(jié)G2-M期檢測點(diǎn)，其所影響細(xì)胞分化過程主要是通過控制細(xì)胞有絲分裂時(shí)期染色體的分離和重組過程〔6〕。在以小鼠為模型進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)，具有BRCA-1基因的人乳腺癌組織生長過程抑制水平低〔7〕。BRCA-1能夠?qū)σ咽軗p的DNA進(jìn)行編碼，并產(chǎn)生相關(guān)蛋白產(chǎn)物，這些產(chǎn)物能夠與參與基因修復(fù)的蛋白質(zhì)之間進(jìn)行相互作用，若BRCA-1表達(dá)水平低，則其對基因修復(fù)能力減弱，從而機(jī)體對鉑類藥物敏感性增強(qiáng)〔8〕。目前，臨床上應(yīng)用的鉑類藥物治療大腸癌患者時(shí)，有許多患者產(chǎn)生耐藥性，并且不同患者之間對鉑類藥物的敏感性也有所不同。Chang等〔9〕報(bào)道，當(dāng)DNA受損時(shí)，可以通過激活的ERCC1核苷酸內(nèi)切酶的作用將受損的基因切除，對腫瘤患者進(jìn)行鉑類治療后，鉑類與DNA能夠形成加合物，次加合物能夠使ERCC1結(jié)合XPF因子，進(jìn)一步激活ERCC1，達(dá)到基因修復(fù)功能?？梢娫阢K類藥物治療腫瘤患者產(chǎn)生耐藥性過程中，ERCC1具有重要意義。Shirota等〔10〕認(rèn)為，癌癥患者ERCC mRNA高表達(dá)這總生存期為1.9個(gè)月，低表達(dá)者總生存期為10.2個(gè)月，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究顯示，ERCC mRNA陰性表達(dá)患者生存期高于陽性表達(dá)患者。這可能是由于陰性表達(dá)患者的ERCC1對DNA修復(fù)能力減弱，使機(jī)體對藥物敏感性增大，鉑類藥物治療效果明顯。在本研究的相關(guān)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，尚不能認(rèn)為ERCC mRNA表達(dá)水平與大腸癌患者的年齡、性別等有關(guān)，而陽性表達(dá)者經(jīng)過鉑類藥物治療后收益更大。

1 Martin LP，Hamilton TC，Schilder RJ.Platinum resistance:the role of DNA repair pathways〔J〕.Clin Cancer Res，2008;14(5):1291-5.

2 逯曉波，安春麗，TaharVan Der Straaten，等.ERCC1蛋白表達(dá)及對草酸鉑細(xì)胞毒作用影響〔J〕.中國公共衛(wèi)生，2007;23(2):206-7.

3 林 莉，劉曉晴，宋三泰.DNA損傷修復(fù)與鉑類耐藥研究進(jìn)展〔J〕.中國腫瘤，2006;15(1):29-31.

4 Cobb MA，Badylak SF，Janas W，et al.Porcine small intestinal submucosa as a dural substitute〔J〕.Surg Neurol，1999;51(1):99-104.

5 Hall JM，Lee MK，Newman B，et al.Linkage of early-onset familial breast cancer to chromosome17q21〔J〕.Science，1990;250(4988):1684-9.

6 Park DJ，Zhang W，Stoehlmacher J，et al.ERCC1 gene polymorphism as a predictor for clinical outcome in advanced colorectal cancer patients treated with platinum-based chemotherapy〔J〕.Clin Adv Hematol Oncol，2003;1(3):162-6.

7 Dejardin LM，Arnoczky SP，Clarke RB.Use of small intestinal submucosal implants for regeneration of large fascial defects:an experimental study in dogs〔J〕.J Biomed Mater Res，1999;46(2):203-11.

8 蘇麗婭，岳秀蘭，曹虹然，等.散發(fā)性乳腺癌中BRCA1基因突變的研究〔J〕.中國腫瘤臨床雜志，2007;34(5):289-90.

9 Chang IY，Kim MH，Kim HB，et al.Small interfering RNA-induced suppression of ERCC1 enhances sensitivity of human cancer cells to cisplatin〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2005;327(1):225-33.

10 Shirota Y，Stoehlmacher J，Brabender J，et al.ERCC1 and thymidylate synthase mRNA levels predict survival for colorectal cancer patients receiving combination oxaliplatin and fluorouracil chemotherapy〔J〕.J Clin Oncol，2001;19(23):4298-304.