李曉峰 于 昆 戴 勇 秦 偉 楊生虎 黨寶寶 韓 云 楊立平 董 晉

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院腹部腔鏡外科，青海 西寧 810000)

膽紅素主要因子多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的三磷酸腺苷結(jié)合運(yùn)載體家族成員，其主要表達(dá)于肝細(xì)胞基底膜并與膽紅素分泌密切相關(guān)〔1〕。MRP2基因的缺失和突變可造成血液中結(jié)合膽紅素大量堆積，誘發(fā)膽紅素代謝障礙并導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。茵陳蒿湯是中醫(yī)治療黃疸的經(jīng)典方劑，具有顯著的保肝作用，但其作用機(jī)制尚未明確。本研究旨在為茵陳蒿湯治療梗阻性黃疸(OJ)提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠50只，來源于中國(guó)科學(xué)院嚙齒類動(dòng)物中心上海分中心，第3代，購(gòu)于青海省地方病預(yù)防控制所，平均體重(201±18.75)g，飼養(yǎng)于青海大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，單籠喂養(yǎng)，室內(nèi)溫度19℃ ～23℃。

1.2 材料 取茵陳蒿湯(茵陳30 g、梔子15 g、大黃10 g)，采用中藥煎制濃縮法:水煎法，每次均先武火后文火煎煮，上藥加水10倍量，浸泡2 h，煎煮30 min，濾過取汁，藥渣加水8倍量，煎煮1 h，濾過取汁，合煎煮30 min，濾過取汁，藥渣加水8倍量，煎煮1 h，濾過取汁，合并2次藥汁混合，過濾，濃縮為120 ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑:Tripure試劑(美國(guó)SIGMA公司)，MRP2一抗〔兔抗鼠多克隆抗體血清(EAG15)，免疫熒光檢查時(shí)稀釋為1∶200〕，RTPCR 試劑盒(PRO-megaCompany)，MRP2 擴(kuò)增的上下游引物、內(nèi)參照3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)擴(kuò)增的上下游引物(上?；倒?，正常山羊血清、焦碳酸二乙酯(DEPC)水、FTI℃山羊抗兔熒光二抗(武漢博士德生物有限公司)，丙酮異丙醇、氯仿、石蠟等(上?；瘜W(xué)試劑公司)。

1.3 方法

1.3.1 分組 將50只大鼠按照隨機(jī)化原則，隨機(jī)抽出10只作為假手術(shù)(SHAM)組，其余40只作為OJ組，造模后將OJ組隨即平均分為OJ實(shí)驗(yàn)組和OJ對(duì)照組。所有SD大鼠均給予普通飼料喂養(yǎng)。按動(dòng)物體表面積比率換算等效劑量法計(jì)算出予以中藥的劑量，OJ實(shí)驗(yàn)組大鼠給予1 ml/100 g茵陳蒿湯灌胃，OJ對(duì)照組大鼠用生理鹽水以同樣方法灌胃，持續(xù)用藥2 w。

1.3.2 OJ模型的建立 OJ組大鼠以25%烏拉坦溶液行腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉成功后，行大鼠腹部皮膚常規(guī)消毒，取腹部正中切口，暴露膽總管，距其起始部位0.5 cm處游離膽總管，以3-0號(hào)線雙重結(jié)扎并切斷，關(guān)腹。假手術(shù)組僅游離膽總管，不作結(jié)扎處理。術(shù)后8～12 h后口飼補(bǔ)液，1 d后自由進(jìn)食，保證充足飲水。

1.3.3 標(biāo)本的采集與處理 25%烏拉坦溶液按1 g/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉成功后，取腹部正中切口打開腹腔，觀察大體形態(tài)，肝臟的色質(zhì)，清除大鼠自然生長(zhǎng)而產(chǎn)生的差異。開腹后經(jīng)下腔靜脈采血3～5 ml，冰浴，離心15 min(4℃，3000 r/min)，取上清置于－70℃保存待測(cè);摘取肝臟后，從肝右葉切取1.0×0.8×0.3 cm3大小肝組織，置10%甲醛固定，逐級(jí)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。

1.3.4 血樣采集及保存 將大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈采血約4～5 ml，二鉀鹽抗凝管離心后取血漿，超低溫冰箱－70℃保存。生化分析儀檢測(cè)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(TB)、總膽汁酸(TBA)。

1.3.5 肝組織MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白檢測(cè) (1)石蠟保存的肝臟標(biāo)本行4 μm 厚切片(先 10 μm 粗切，后 4 μm 細(xì)切)，載玻片撈片;(2)切片脫蠟水化:二甲苯脫水各5 min，無(wú)水酒精、95%、90%、80%酒精依次梯度脫水5 min;(3)室溫放置30 min，用20℃丙酮固定10 min，自然風(fēng)干;(4)用緩沖液沖洗，5 min×3次，每間隔5 min/次;(5)先封閉，用正常山羊血清磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，室溫孵育20 min，棄去血清，置于室溫編號(hào)入濕盒;(6)以正常山羊血清PBS、一抗(1∶200)稀釋液封閉，4℃孵育冰箱過夜;(7)次日用PBS沖洗，5 min×3次，未結(jié)合的抗體用0.01 mol/L，pH7.2的PBS輕震蕩洗滌，10 min×2次;(8)以下步驟避光，加封閉液稀釋的山羊抗兔熒光二抗，室溫下孵育30～60 min;(9)PBS沖洗，5 min×3次，最后用蒸餾水沖洗1次，自然風(fēng)干;(10)甘油PBS封片，鏡檢;(11)CMIA圖像分析儀測(cè)定MRP2表達(dá)以相對(duì)灰度值表示。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn):深黃色或棕黃色為強(qiáng)陽(yáng)性()，黃色為陽(yáng)性()，淺黃色為弱陽(yáng)性(+)，與背景同色者為陰性(-)。用醫(yī)學(xué)圖文系統(tǒng)分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)定MRP2陽(yáng)性纖維的平均光密度，灰度值越大，表示MRP2的含量越高。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 OJ大鼠肝臟病理學(xué)變化 OJ組大鼠肝血管充血，肝細(xì)胞腫脹，氣球樣變性，出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死，肝內(nèi)膽管擴(kuò)張，小葉周邊可見新生小膽管樣上皮細(xì)胞，以匯管區(qū)明顯，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。SHAM組病變較輕，未見明顯差異。見圖1。

2.2 茵陳蒿湯對(duì)OJ大鼠肝功能的影響 OJ實(shí)驗(yàn)組和OJ對(duì)照組中 AST、ALB、TB、TBA 均明顯高于 SHAM 組(P＜0.05);而OJ實(shí)驗(yàn)組各指標(biāo)均顯著低于OJ對(duì)照組(P＜0.05)。見表1。

圖1 各組大鼠肝臟病理學(xué)改變

表1 各組肝功能檢查結(jié)果比較(±s，U/L)

表1 各組肝功能檢查結(jié)果比較(±s，U/L)

與SHAM組比較:1)P＜0.05;與OJ實(shí)驗(yàn)組比較:2)P＜0.05

16 OJ實(shí)驗(yàn)組 20589.34±60.481) 15.16±2.161) 628.67±68.451) 691.56±30.821)OJ對(duì)照組 20736.52±40.821)2) 19.28±1.561)2) 765.35±32.691)2) 779.32±49.231)2)AST ALB TB TBA SHAM組 1031.52±3.128.02±1.5319.26±2.9415.06±2.組別 n

2.3 茵陳蒿湯對(duì)OJ大鼠肝組織MRP2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率的影響OJ實(shí)驗(yàn)組和OJ對(duì)照組肝組織MRP2的表達(dá)陽(yáng)性率顯著低于SHAM組(100%，+20%，30%，50%);而OJ實(shí)驗(yàn)組肝組織MRP2的表達(dá)陽(yáng)性率(50%，+40%，10%)顯著高于OJ對(duì)照組(30%，均為+)(P＜0.05)。

3 討論

膽汁的形成、分泌和排泄機(jī)制非常復(fù)雜，膽汁酸是膽汁中的一種以K鹽和Na鹽的形式存在的膽烷酸。膽汁酸主要由膽固醇轉(zhuǎn)化而來，在代謝過程中經(jīng)過肝腸循環(huán)，在腸道有95%膽汁酸被重新吸收，經(jīng)門靜脈血流入肝臟，正常人體中的膽汁酸基本完全被肝臟攝取〔2〕。膽汁酸幾乎是唯一可同時(shí)反映肝細(xì)胞合成功能及肝細(xì)胞損傷的血清學(xué)指標(biāo)。正常人血中膽汁酸水平的升高必然導(dǎo)致肝細(xì)胞病變，在各種急慢性肝病中，膽汁酸的水平基本與病情表現(xiàn)保持平行。目前已知高膽汁酸血癥引發(fā)肝細(xì)胞損害的機(jī)制包括:(1)高膽汁酸與高膽紅素引發(fā)能量代謝改變，從而引發(fā)肝細(xì)胞損害;(2)OJ引起的代謝紊亂改變了正常肝臟的血流動(dòng)力學(xué)，從而引起肝細(xì)胞受損;(3)OJ引起的高膽汁酸狀態(tài)影響了呼吸鏈電子的傳遞;(4)OJ引起的高膽汁酸狀態(tài)導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)Ca、Mg濃度變化，從而激發(fā)了蛋白激酶PKC導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;(5)OJ的高膽汁酸作用導(dǎo)致肝臟KC細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，從而影響機(jī)體正常的免疫功能;(6)OJ的高膽汁酸引起腸源性內(nèi)毒素血癥，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷〔3〕。MRP2通過對(duì)膽紅素與膽汁酸的調(diào)節(jié)，降低膽汁酸的水平，其可能機(jī)制是:(1)MRP2調(diào)節(jié)膽汁內(nèi)一些具備生物活性的谷胱甘肽結(jié)合物以及葡萄糖醛酸與硫酸鹽結(jié)合物的分泌，結(jié)合體內(nèi)的高膽汁酸，降低膽汁酸濃度，保護(hù)肝臟細(xì)胞。(2)MRP2參與調(diào)整體內(nèi)膽汁酸的重新分布，將膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)到MRP2基因表達(dá)的細(xì)胞膜，起到類似屏障的作用。(3)MRP2調(diào)節(jié)膽汁分泌，從而保護(hù)肝細(xì)胞〔4〕。茵陳蒿湯是中醫(yī)治療黃疸的經(jīng)典方劑，方由茵陳蒿、梔子、大黃三味藥組成，方中用茵陳清熱利濕，疏利肝膽為君;梔子清泄三焦?jié)駸?，并可退黃為臣;大黃通利大便，導(dǎo)熱下行為佐，三藥相配，使?jié)駸嶂皬亩闩判?，濕去熱除，則發(fā)黃自退〔5〕?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，茵陳蒿湯能維持肝細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定，中和可溶性細(xì)胞因子，防止肝臟細(xì)胞的纖維化和壞死，清除自由基，預(yù)防超氧化物陰離子引起的成纖維細(xì)胞的損傷，清除體內(nèi)內(nèi)毒素的自由基，降低血清內(nèi)毒素水平，保護(hù)肝細(xì)胞膜，預(yù)防肝細(xì)胞壞死，促進(jìn)肝細(xì)胞再生及保障肝細(xì)胞微循環(huán)，誘導(dǎo)肝臟酶系統(tǒng)對(duì)膽紅素的攝取，松弛膽道括約肌，增加膽汁流量，加速膽汁排泄〔6〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示OJ中存在膽汁酸代謝紊亂和肝細(xì)胞損害，而茵陳蒿湯灌胃處理可起到有效的保肝作用，降低OJ所致的膽汁酸代謝紊亂和肝細(xì)胞損害;并且，MRP2可能是通過調(diào)節(jié)膽汁酸代謝參與OJ發(fā)生與發(fā)展，而調(diào)節(jié)MRP2表達(dá)可能是茵陳蒿湯發(fā)揮治療作用的主要機(jī)制。

1 龔 慧，顏 苗，李煥德，等.甘草提取物對(duì)小鼠肝臟核因子E2相關(guān)因子2及其下游基因表達(dá)的影響〔J〕.中藥新藥與臨床藥理，2014;25(2):135-6.

2 唐建文，芮 景.MRP2和NF-κB在阻塞性黃疸大鼠肝細(xì)胞中表達(dá)變化及意義〔J〕.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2011;20(10):936-8.

3 梁科偉，袁晟光.膽汁酸與肝再生〔J〕.世界華人消化雜志，2011;19(22):2340-5.

4 甘思遠(yuǎn)，區(qū)增冠，孫艷芹，等.MRP2蛋白在食管鱗癌中的表達(dá)及其與化療耐藥的相關(guān)性〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012;12(25):4863-5.

5 劉 瑩，張會(huì)存，段 娜，等.茵陳蒿湯對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)大鼠非酒精性脂肪性肝炎的藥效學(xué)觀察〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012;18(13):217-9.

6 徐國(guó)萍，白 娟，舒靜娜，等.茵陳蒿湯的藥理研究進(jìn)展〔J〕.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011;21(1):64-7.