謝盈彧 曹 楊 方子寒 張夢(mèng)迪 薛 亮 范英昌 (天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 30093)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一類(lèi)存在于骨髓中的具有多種分化潛能的非造血多能干細(xì)胞，在不同的誘導(dǎo)條件下，BMSCs可以分化為心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞等多種類(lèi)型的組織細(xì)胞〔1，2〕，因其容易獲得，不存在免疫排斥等優(yōu)點(diǎn)而被看作組織工程的“種子細(xì)胞”〔3〕。研究提示微環(huán)境在誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞分化中的重要作用，其中采用的共培養(yǎng)技術(shù)提供了一個(gè)非常好的研究影響細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的各種體內(nèi)因素的模型〔4〕。本實(shí)驗(yàn)以大鼠BMSCs與新生大鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)模擬心肌內(nèi)環(huán)境，研究心肌直接接觸、transwell小室建立的間接接觸培養(yǎng)對(duì)BMSCs分化的影響，獲取BMSCs向心肌細(xì)胞分化的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器及試劑 清潔級(jí)Wistar雄性大鼠，(200±20)g，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào):scxk2005-0001)5%二氧化碳(CO2)恒溫培養(yǎng)箱(Thermo);倒置相差顯微鏡(XD-10198010);凝膠圖像分析儀(Pramega公司);PCR儀為PE29600DNA熱循環(huán)儀(Perkin2ElmerCetus)。L-DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司);特級(jí)胎牛血清(FBS，美國(guó)Hyclone公司);胰蛋白酶(1∶250，美國(guó)Hyclone公司);Percoll(Parmacia);乙二胺四乙酸(EDTA，天象人生物技術(shù)研究所 );青、鏈霉素(Hyclone);D-Hank液(南京化學(xué)試劑廠);CD44兔多克隆抗體(HCAM)，CD34兔多克隆抗體(Rabbit Anti-CD34)，即用型SABC免疫組化染色試劑盒，DAB顯色試劑盒AR1025，均由武漢博士德生物工程有限公司提供;磷酸鹽緩沖液(PBS)，95%乙醇，Triton-X-100(AMRESCO)，山羊血清，兔抗大鼠心肌肌鈣蛋白T(cTnT)單克隆抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG;PCR引物(Takara公司)，Cpn PCR試劑盒(批號(hào)980316，廣東老年醫(yī)學(xué)研究所中心實(shí)驗(yàn)室)。

1.2 BMSCs的分離與培養(yǎng) 采用貼壁培養(yǎng)和密度梯度離心結(jié)合法，取雄性Wistar大鼠，頸椎脫臼處死，無(wú)菌條件下取雙側(cè)股骨、脛骨，適量D-Hank液沖洗骨髓，100目篩網(wǎng)過(guò)濾，采用Percoll分離液(密度1.073 g/ml)，行密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，用L-DMEM離心洗滌2次(800 r/min，5 min)。以3.0×105個(gè)/cm2的密度接種于完全培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后首次換液，以后每3天更換一次培養(yǎng)液。2 w后，細(xì)胞80%長(zhǎng)滿瓶底。待細(xì)胞融合至80%～90%，加入0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA消化細(xì)胞，按1∶3傳代接種于75 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，待細(xì)胞鋪滿瓶底后依上法傳代。

1.3 BMSCs的鑒定與標(biāo)記 選用第三代MSCs，用鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(SABC)法檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD44和CD34。將第5～6代的 MSCs用4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(1 μg/ml)標(biāo)記2 h，用D-Hank液漂洗10次后，在熒光顯微鏡下用紫外光激發(fā)(激發(fā)波長(zhǎng)340～380 nm)，觀察標(biāo)記效果。

1.4 心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 于無(wú)菌操作下，開(kāi)胸取出雄性Wistar大鼠心臟(留心尖部)，于4℃的D-Hank液中漂洗3～4次，將心尖部組織剪成1 mm3碎塊，加入4 ml的0.0625%胰蛋白酶液，于37℃恒溫水浴箱中消化3 min，棄上清。向剩余沉淀中加入混合消化液5 ml(0.0625%胰蛋白酶+0.1%Ⅱ型膠原酶)，置37℃水浴消化8～10 min，其間振蕩2～3次，靜置后將上清液移入離心管中，加含10%胎牛血清預(yù)冷的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化。重復(fù)上述方法消化7～8次，至組織塊基本消化完畢。收集各次上清液并終止消化后，用200目的尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾去除殘留組織塊，以1000 r/min速度離心8 min，將所得的細(xì)胞與培養(yǎng)液混懸后，采用差速貼壁分離法去除心肌成纖維細(xì)胞每次2 h，吸出心肌細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)板中。培養(yǎng)前3 d加入0.1 mmol/L BrdU抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。48 h首次換液，以后根據(jù)情況2～3 d換液。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 直接接觸共培養(yǎng)組:把心肌細(xì)胞和DAPIMSCs以40∶1比例混合后，按適當(dāng)密度接種于含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)板內(nèi)。間接接觸共培養(yǎng)組:應(yīng)用transwell培養(yǎng)板建立細(xì)胞間接共培養(yǎng)體系，上層接種原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞心肌細(xì)胞，下層接種DAPI-MSCs。兩種細(xì)胞以與直接接觸共培養(yǎng)組相同密度加入此體系中培養(yǎng)。兩組間分開(kāi)培養(yǎng)，待各自貼壁后更換新的含血清DMEM培養(yǎng)基置于37℃，5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行間接接觸共培養(yǎng)。

1.6 測(cè)定指標(biāo)

1.6.1 免疫熒光檢測(cè) 培養(yǎng)2 w后將培養(yǎng)板底部的蓋玻片取出，PBS清洗，用95%的乙醇固定20 min，PBS清洗3次后，0.3%Triton室溫下細(xì)胞膜打孔20 min，用山羊血清封閉，滴加一抗(兔抗大鼠心肌肌鈣蛋白T單克隆抗體)，4℃過(guò)夜后，滴加二抗(FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG)于室溫1～3 h行TroponinT免疫熒光染色，以檢測(cè)BMSCs分化為心肌樣細(xì)胞時(shí)cTnT在胞質(zhì)中的表達(dá)。采用免疫熒光雙染色技術(shù)MSCs的細(xì)胞核經(jīng)DAPI標(biāo)記后的MSCs在紫外光激發(fā)下胞核呈藍(lán)色熒光，用共聚焦顯微鏡將“DAPI”與“FTIC”圖像合成。若觀察到雙陽(yáng)性細(xì)胞即胞核呈藍(lán)色熒光、胞質(zhì)呈綠色熒光，則提示BMSCs向CM發(fā)生了定向分化。

1.6.2 心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化率計(jì)算 觀察干預(yù)后MSCs的定向誘導(dǎo)情況，用免疫熒光方法標(biāo)記cTnT。倒置相差顯微鏡，視野(×200)隨機(jī)取4個(gè)視野，直接接觸組計(jì)算cTnT綠色熒光蛋白雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占綠色熒光蛋白陽(yáng)性的比例;間接接觸組計(jì)算cTnT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比率。

1.6.3實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞cTnTmRNA表達(dá)采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA測(cè)定OD值，計(jì)算總RNA純度，按RT-PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:70℃5min，42℃60min，70℃10min，終止反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)為94℃30s，60℃30s，72℃30s，共32個(gè)循環(huán)后，再于72℃延伸7min。cTnT上游引物:5＇-GGCAGCGGAAGAGGATGCTGAA-3＇;下游引物:5＇-GAGGCACCAAGTTGGGCATGAACGA-3＇;GAPDH上游引物:5＇GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3＇;下游引物:5＇-TGCTGAGTATGTCGTGGAG-3＇。β-actin反應(yīng)條件為:94℃5min預(yù)變性后，94℃30s，55℃30s，72℃30s，共28個(gè)循環(huán)后，再于72℃延伸7min?？偡磻?yīng)體系為50μl，包括cDNA3μl，1mmol/LdNTPs10μl，10×Taq聚合酶緩沖液5μl，目的基因和β-actin上下游引物各2μl(10pmol/L)，Mg2+3μl，去離子水24μl，Taq酶1μl。所得CT值經(jīng)轉(zhuǎn)換后以2-△△CT相對(duì)定量法獲得每個(gè)樣本各目的基因相對(duì)表達(dá)量數(shù)值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析，兩者比較方差齊者采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnett T3檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定 BMSCs原代培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)貼壁細(xì)胞，呈紡錘狀的成纖維細(xì)胞樣外觀。3 d后，細(xì)始呈集落樣生長(zhǎng)，增殖明顯，呈現(xiàn)多種形態(tài)，主要為成纖維細(xì)胞樣，細(xì)胞呈梭形或星形，體積較小，隨著繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞體積增大，約14 d后可鋪滿瓶底。經(jīng)傳代的BMSCs在24 h內(nèi)完全貼壁，呈長(zhǎng)梭形;3 d后，細(xì)胞體積較原代細(xì)胞明顯增大，多呈扁平狀、多角形，胞核清晰呈卵圓形，可見(jiàn)較多雙核細(xì)胞存在，提示細(xì)胞處于分裂狀態(tài)。7 d后細(xì)胞基本鋪滿瓶底，細(xì)胞間隙變小，細(xì)胞排列無(wú)明顯方向性。隨著傳代，細(xì)胞得到純化，梭形細(xì)胞達(dá)到95%以上(圖1)。經(jīng)DAPI標(biāo)記后，細(xì)胞核在熒光激發(fā)下通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)藍(lán)光，計(jì)數(shù)細(xì)胞陽(yáng)性率為100%。BMSCs免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示CD44呈陽(yáng)性表達(dá)，CD34呈陰性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含棕黃色、顆粒狀物質(zhì)(圖2)。

圖1 BMSCs原代培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察(×100)

2.2 心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定 剛分離的心肌細(xì)胞呈圓形，培養(yǎng)2 h后成纖維細(xì)胞基本完全貼壁，而少數(shù)心肌細(xì)胞8 h左右開(kāi)始貼壁，少數(shù)貼壁的單個(gè)心肌細(xì)胞出現(xiàn)了自發(fā)性搏動(dòng)，搏動(dòng)的頻率、節(jié)律各不同。24 h后搏動(dòng)的心肌細(xì)胞百分率大約為50%，搏動(dòng)頻率較分散，約30～50次/min。至48 h視野下細(xì)胞呈梭形，板形，三角形或扁平不規(guī)則形，折光度較高，細(xì)胞中隱約可見(jiàn)細(xì)胞核，搏動(dòng)的心肌細(xì)胞百分率大于90%，搏動(dòng)頻率多集中在50～80次/min，72 h后細(xì)胞充分鋪展，貼壁牢固，少數(shù)局部呈均一搏動(dòng)頻率，可達(dá)80～100次/min(圖3)。在免疫熒光染色時(shí)一抗選用羊抗大鼠心肌特異性cTnT的單克隆抗體，二抗選用FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，觀察到心肌細(xì)胞中胞質(zhì)呈綠色熒光，即顯示心肌cTnT在胞質(zhì)中已表達(dá)(圖3)。

圖2 BMSCs CD34、CD44表達(dá)(×400)

圖3 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

2.3 共培養(yǎng)后BMSCs形態(tài)學(xué)觀察 BMSCs與心肌細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)后，形態(tài)發(fā)生明顯變化，倒置相差顯微鏡下觀察可見(jiàn)與心肌細(xì)胞直接接觸的梭形BMSCs逐漸縮短，胞體稍增粗。BMSCs與心肌細(xì)胞間接接觸共培養(yǎng)后，BMSCs體積增大，梭形形態(tài)逐漸變短變粗，近似棒狀或橢圓形，細(xì)胞之間彼此靠近并出現(xiàn)連接，排列方向趨于一致。

2.4 共培養(yǎng)后BMSCs免疫熒光檢測(cè)及分化率計(jì)算 BMSCs分化為心肌樣細(xì)胞時(shí)心肌cTnT免疫熒光染色呈陽(yáng)性，細(xì)胞分化率分析顯示，直接接觸共培養(yǎng)組與間接接觸共培養(yǎng)組中cTnT均表達(dá)，直接接觸共培養(yǎng)組分化率為22.42%±9.97%，間接接觸組分化率為4.81%±2.52%，其中間接接觸共培養(yǎng)組的分化率明顯低于直接接觸共培養(yǎng)組。RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞cTnT mRNA的表達(dá)，OD260/OD280比值在1.8～2.0范圍內(nèi)，RNA純度較高。觀察電泳結(jié)果出現(xiàn)28S、18S和5S三條帶，確定RNA有較好的完整性。

3 討論

BMSCs以強(qiáng)大的自我更新能力和分化潛能成為多系統(tǒng)疾病細(xì)胞替代治療研究熱點(diǎn)，成為心肌梗死治療較為理想的細(xì)胞來(lái)源，為進(jìn)行細(xì)胞移植治療心肌梗死疾病開(kāi)辟全新的治療策略。以往實(shí)驗(yàn)中單純藥物刺激難以模擬體內(nèi)微環(huán)境，體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)又很難區(qū)分細(xì)胞融合還是細(xì)胞分化，因此近年來(lái)許多研究工作者采用共培(co-culture)的方法模擬體內(nèi)微環(huán)境，研究BMSCs的分化可塑性〔5，6〕。BMSCs向特定細(xì)胞分化的能力受局部微環(huán)境的調(diào)控，在體外通過(guò)成體干細(xì)胞目的細(xì)胞共培養(yǎng)能在一定程度上“再現(xiàn)”體內(nèi)微環(huán)境并成功誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化〔7〕。

本實(shí)驗(yàn)直接培養(yǎng)組中，將BMSCs與心肌細(xì)胞混勻直接培養(yǎng);間接培養(yǎng)組中，利用Transwell小室建立體外微環(huán)境誘導(dǎo)BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化。Transwell小室，是一個(gè)可放置在孔板里的小杯子，杯底層有一張通透性的半透膜，此膜能夠阻隔細(xì)胞，允許培養(yǎng)液及細(xì)胞代謝物自由通過(guò)。實(shí)驗(yàn)利用免疫熒光和自動(dòng)化程度高且特異性更強(qiáng)的RT-PCR技術(shù)檢測(cè)BMSCs分化為心肌樣細(xì)胞時(shí)cTnT在胞質(zhì)中的表達(dá)，cTnT是心肌細(xì)胞中特異性的結(jié)構(gòu)蛋白，僅在心肌細(xì)胞中表現(xiàn)，是用來(lái)鑒定心肌細(xì)胞的重要指標(biāo)〔8，9〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，直接接觸組的cTnT表達(dá)率明顯優(yōu)于間接接觸組，直接接觸共培養(yǎng)BMSCs向心肌細(xì)胞的分化率優(yōu)于間接接觸組。

本實(shí)驗(yàn)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的區(qū)別是構(gòu)建的心肌微環(huán)境的不同，出現(xiàn)不同結(jié)果的原因是模擬心肌微環(huán)境對(duì)于BMSCs的分化作用的影響不同。目前研究顯示，細(xì)胞間接觸及通話是器官發(fā)生、胚胎發(fā)生的關(guān)鍵因素，微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞分化成其他細(xì)胞發(fā)揮著重要作用。干細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)不同器官能在不同的環(huán)境及生長(zhǎng)因子作用下發(fā)生定向分化，微環(huán)境是誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素。在體外通過(guò)成體干細(xì)胞與目的細(xì)胞共培養(yǎng)能在一定程度上“再現(xiàn)”體內(nèi)微環(huán)境并成功誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化。共同培養(yǎng)的微環(huán)境中存在著很多影響因素，機(jī)械因素和化學(xué)因素(心肌細(xì)胞分泌的一些細(xì)胞因子和可溶性的化學(xué)物質(zhì))〔10〕，BMSCs修復(fù)受損心肌的能力可能是多途徑共同作用的結(jié)果，而不是通過(guò)單一途徑實(shí)現(xiàn)的。

雖然體外微環(huán)境對(duì)于BMSCs心肌樣分化的影響因素可歸結(jié)為化學(xué)和物理刺激，但這些因素及其作用機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，目前尚未有定論，極大地限制了心肌微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的影響的研究發(fā)展。未來(lái)，將近一步深入與完善心肌微環(huán)境對(duì)BMSCs向心肌細(xì)胞分化的影響及其機(jī)制的研究。

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〔2013-12-09修回〕