王麗平 王紹欣 段娜娜 程建新 汪硯雨 王 可 劉相勇 魏利娟 孟雅麗

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，河南 洛陽 471003)

心肌標(biāo)志物的檢測在診斷急性心肌梗死(AMI)方面發(fā)揮著主要作用，2012年歐洲心臟病學(xué)會(ESC)在心肌梗死的定義中也強(qiáng)調(diào)了心肌標(biāo)志物的地位。AMI患者由于就診時(shí)間不確定，早期檢測血清心肌標(biāo)志物可能出現(xiàn)較大偏倚，而動物實(shí)驗(yàn)可準(zhǔn)確控制心肌梗死的時(shí)間點(diǎn)，真實(shí)反映心肌標(biāo)志物的變化規(guī)律。近年研究表明血清缺血修飾白蛋白(IMA)是一個(gè)早期敏感的心肌缺血診斷指標(biāo)，其敏感性顯著高于傳統(tǒng)的生化標(biāo)志物〔1〕。本實(shí)驗(yàn)通過經(jīng)皮明膠海綿栓塞冠狀動脈法建立豬AMI模型并觀察IMA動態(tài)演變，為AMI的早期診斷提供臨床數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及主要儀器 中國動物試驗(yàn)用中華小型豬16只，由江蘇泰州泰和生物科技有限公司提供。體重10～20 kg，同種同窩，雌雄不限。試驗(yàn)過程中對動物的處理符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。介入材料(Guiding導(dǎo)管、微導(dǎo)管、6F動脈鞘管)、心電監(jiān)護(hù)儀、除顫儀、麻醉藥品、搶救藥品、試劑盒、酶標(biāo)儀等。

1.2 試驗(yàn)方法術(shù)前禁食禁水8 h，肌注安定10 mg，5 min后，經(jīng)豬耳緣靜脈用靜脈套管針建立靜脈通路，氯胺酮10 mg/kg緩慢靜推麻醉后，將小型豬仰臥位固定至導(dǎo)管床，靜推阿托品25 μg/kg抑制口腔分泌物，保持呼吸道通暢，呼吸機(jī)及除顫儀備用。連接心電監(jiān)護(hù)電極及四肢導(dǎo)聯(lián)，心率160～200次/min。在手術(shù)過程中根據(jù)豬肢體活動情況靜脈輪流追加氯胺酮20 mg/次及地西泮(安定)5 mg/次，觀察生命體征，避免呼吸抑制。手術(shù)方法:①達(dá)到麻醉理想狀態(tài)后，常規(guī)消毒鋪巾，用橈動脈穿刺針以seldinger法穿刺豬右側(cè)股動脈，將6F橈動脈鞘植入豬股動脈，鞘內(nèi)注射肝素10 000 U，以后每隔1 h追加2 000 U。②在X射線血管造影機(jī)下，采用左前斜45°，在J型導(dǎo)絲的引導(dǎo)下，送6F JR4.0Guiding導(dǎo)管至升主動脈根部測壓力165/130 mmHg，再分別進(jìn)入左右冠狀動脈多體位造影，多體位投照，明確分析冠狀動脈分布。③將一Runthrough NS導(dǎo)絲送入回旋支遠(yuǎn)端，送另一Runthrough NS導(dǎo)絲至OM支，沿此NS導(dǎo)絲送入微導(dǎo)管至鈍緣支，沿微導(dǎo)管緩慢勻速注入明膠海綿混懸液約2 ml，造成鈍緣支閉塞，行冠脈造影示鈍緣支血流中斷，成功建立心梗模型。④撤出NS導(dǎo)絲及微導(dǎo)管，在J型導(dǎo)絲引導(dǎo)下撤出指引導(dǎo)管，拔出橈動脈鞘，將鎖骨下靜脈管植入豬股動脈內(nèi)，繃帶加壓包扎固定。⑤術(shù)后每天給予肝素3 000 U皮下注射，口服阿司匹林75 mg/d。

1.3 心肌標(biāo)志物檢測 分別于術(shù)前及術(shù)后10 min、30 min、1、2、3、4、6、8、10、12、24、48 h 抽取豬耳緣靜脈血，在 30 min 內(nèi)以3 000 r/min離心，分離出血清后放在－80℃的冰箱保存待用。用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測IMA，試劑盒由艾萊薩生物科技(上海)有限公司提供。嚴(yán)格按照試劑盒的說明書操作，用美國伯騰酶標(biāo)儀完成測定。

病理檢查:分別于術(shù)后1、3、5、7、10 d將豬處死，取出心臟用0.9%生理鹽水灌洗干凈，置于40 g/L的甲醛液中固定7 d，于側(cè)壁及左室后壁梗死區(qū)、缺血區(qū)和正常區(qū)中心切取0.3 cm×0.3 cm的組織，分別用70%、80%、90%、95%、100%的乙醇脫水2～4 h，二甲苯透明30 min，再浸蠟、包埋，制成4 μm厚的石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0軟件行重復(fù)測量方差分析。

2 結(jié)果

2.1 模型建立結(jié)果在AMI模型制作過程中共有15頭豬存活且達(dá)到AMI動物模型標(biāo)準(zhǔn)，其中1頭在模型制作完成后24 h因煩躁呼吸窘迫死亡，解剖后證實(shí)死于肺栓塞。

2.2 冠脈堵閉情況 15只豬成功完成冠脈造影，明膠海綿混懸液均成功注入LCX第一鈍緣支，見圖1。

圖1 冠狀動脈造影圖像

2.3 豬心電圖(ECG)變化 明膠海綿混懸液堵塞豬第一鈍緣支后ECG可見相關(guān)導(dǎo)聯(lián)ST段抬高，見圖2。

圖2 心電圖變化

2.4 IMA水平檢測 術(shù)前血清IMA水平為(37.8±0.16)U/ml在豬心梗模型建立成功10 min后血清IMA〔(70.1±0.19)U/ml〕開始迅速升高，30 min、1 h、2 h、3 h、4 h IMA 水平分別為(91.3±0.42)、(105.7±0.15)、(116.0±0.33)、(126.9±0.30)、(133.5±0.55)U/ml，6 h 達(dá) 到 峰 值 〔(142.6±0.39)U/ml〕，之后開始下降，術(shù)后 8、10、12、24 h IMA 水平分別為(131.7±0.41)、(122.1±0.32)、(102.0±0.53)、(41.6±0.60)U/ml，48 h時(shí) IMA 在血中的濃度〔(31.9±0.38)U/ml〕接近正常范圍。

采用重復(fù)測量方差分析得出F值為1.019×104，各時(shí)間點(diǎn)IMA濃度與術(shù)前相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);48 h時(shí)間點(diǎn)與術(shù)前比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.5 病理檢測結(jié)果新鮮心臟標(biāo)本可見14只豬心肌壞死部位基本一致，位于左室的側(cè)壁及后壁，梗死區(qū)室壁變薄顏色灰白，梗死隨時(shí)間的延長質(zhì)地變硬凹陷。

蘇木素-伊紅染色顯示未梗死心肌細(xì)胞排列整齊、形態(tài)正常、分界清楚，細(xì)胞核位于中心，胞質(zhì)染色均勻，心肌橫紋可見。梗死區(qū)在左室的側(cè)壁及后壁，光鏡下梗死區(qū)心肌細(xì)胞變性、胞質(zhì)深染，核固縮消失，胞質(zhì)溶解，肌纖維斷裂，纖維組織增生，橫紋模糊，各種細(xì)胞排列紊亂，炎性細(xì)胞浸潤。見圖3。

圖3 AMI模型病理改變(HE，×400)

3 討論

成功建立AMI動物模型可為心肌標(biāo)志物的研究搭建一個(gè)良好的平臺。目前國內(nèi)外多通過開胸結(jié)扎鼠、兔等小型動物的不同部位的冠狀動脈建立AMI動物模型，但開胸結(jié)扎手術(shù)復(fù)雜，創(chuàng)傷大，術(shù)后恢復(fù)慢、易感染、死亡率高，且小動物與人體的切合度偏低，不利于實(shí)驗(yàn)研究。隨著介入治療技術(shù)的成熟及普及，經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)建立AMI模型對動物創(chuàng)傷小、死亡率低、術(shù)后容易飼養(yǎng)、恢復(fù)較快。豬在生理特點(diǎn)、疾病發(fā)生和冠脈解剖結(jié)構(gòu)方面與人類相近，血管內(nèi)膜和心肌損傷的機(jī)制和恢復(fù)的時(shí)間也與人類相似〔2〕。本實(shí)驗(yàn)采用seldinger法穿刺豬股動脈來建立心肌梗死模型創(chuàng)傷小，簡單易行，操作方便，可重復(fù)性強(qiáng)，國內(nèi)外鮮有報(bào)道。

在AMI早期心肌缺血時(shí)，缺血心肌局部血流灌溉不足氧供減少，組織細(xì)胞反應(yīng)性氧產(chǎn)物增多、酸中毒、自由基損害，細(xì)胞膜上的各種能量依賴性離子泵破壞等代謝變化，使血清白蛋白(HSA)的性質(zhì)發(fā)生變化，氨基的N端的2～4個(gè)氨基酸殘基被氧化修飾產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)的改變，而導(dǎo)致了與過渡金屬結(jié)合能力下降，使HSA轉(zhuǎn)化為IMA。在心肌缺血或壞死早期，心肌壞死標(biāo)志物均為陰性時(shí)，IMA作為高敏的缺血指標(biāo)就可在血液中檢出，可以幫助AMI的早期診斷，以便在疾病的可逆期內(nèi)進(jìn)行危險(xiǎn)分層及干預(yù)來改善患者的預(yù)后，減少病死率〔3〕。

IMA對心肌缺血有很高的靈敏度〔4，5〕。還可用于急性胸痛患者的排除診斷及AMI的危險(xiǎn)分層〔6，7〕。既是心肌缺血開始時(shí)的敏感標(biāo)志物，在AMI的排除診斷中發(fā)揮著重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)通過建立豬AMI模型，完整地反映了從心肌缺血到梗死的病理演變，客觀準(zhǔn)確科學(xué)地反映了心肌酶的動態(tài)變化過程。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IMA在心肌梗死后10 min后迅速升高，6 h達(dá)到峰值，之后開始逐漸下降，約48 h降至正常。傳統(tǒng)的心肌標(biāo)志物如cTnI、肌酸激酶同工酶(CK-MB)在診斷AMI方面都有較高的特異性，但多在心肌損傷后4～6 h后才會出現(xiàn)，在心肌缺血的可逆期內(nèi)多檢測不到〔8〕。IMA高度的敏感性能在可逆期尚未發(fā)生心肌梗死情況下迅速檢測出心肌缺血及損傷，有助于急診室胸痛患者的早期診斷及排除急性心臟疾病，避免因漏診冠狀動脈病變而造成嚴(yán)重的后果。

IMA可隨血液循環(huán)于體內(nèi)各個(gè)組織器官，在非心源性缺血的情況下如腦、肺、胃腸道和骨骼肌缺血時(shí)IMA也會增高，其特異性較低〔9〕。但其高度的敏感性適用于cTnI陰性且ECG正常的胸痛患者的心肌缺血或心肌梗死的排除診斷，所以在診斷AMI時(shí)應(yīng)結(jié)合其他的心肌生化標(biāo)志物、ECG及臨床癥狀體征來綜合分析，從而快速準(zhǔn)確地診斷病情，讓患者得到及時(shí)有效的治療?，F(xiàn)在主張AMI患者同時(shí)檢測cTn和IMA，提高AMI的靈敏度且可使確診的時(shí)間提前。

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