王志學 張曉俠 雷 燕 李汝泓 劉新偉 賈瑞林 (承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院麻醉科，河北 承德 067000)

前期研究證實〔1～4〕，一定濃度的嗎啡、5-氟尿嘧啶(5-FU)及聯(lián)合應用48 h對MCF-7乳腺癌細胞有促進凋亡作用，并顯著下調(diào)Bcl-2表達和上調(diào)Bax表達，兩藥聯(lián)合應用啟動內(nèi)源性凋亡途徑具有協(xié)同作用。同為強效阿片受體激動劑的芬太尼，曾主要應用于圍術期鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、創(chuàng)傷痛。由于其鎮(zhèn)痛強度高，起效迅速，以及新的劑型和工藝的不斷出現(xiàn)，近年來在癌痛治療領域應用亦越來越廣泛。有報道顯示〔5～7〕，芬太尼也能劑量依賴性地誘導MCF-7人乳腺癌細胞凋亡、抑制增殖，并能使腫瘤細胞所致的組織破壞顯著減少。然而，芬太尼與5-FU聯(lián)合應用對乳腺癌細胞凋亡的影響是否也有嗎啡類似的效應以及內(nèi)源性凋亡途徑的依賴性尚有待闡明。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 碘化丙啶(PI)，美國Sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)基，GIBCO BRL公司;胎牛血清，天津血液學研究所;胰蛋白酶，中國醫(yī)學科學院血研所科技公司;鼠抗人Bcl-2及Bax Western印跡單克隆抗體，福州邁新生物技術有限公司;β-actin一抗、山羊抗鼠Western印跡二抗，美國Santa Cruz公司。YT-CJ-1N超凈工作臺，北京亞泰科隆實驗科技開發(fā)中心;FACS Calibur流式細胞儀，美國B＆D公司;CO2電熱恒溫培養(yǎng)箱，日本SANYO公司;LD5-IA低速離心機，北京雷勃爾離心機有限公司;QL-901振蕩器，中國其林貝爾;熒光倒置顯微鏡，日本尼康;光學顯微鏡、倒置顯微鏡，日本OLYMPUS。

1.1.2 實驗藥物 芬太尼注射液，宜昌人福藥業(yè);5-FU注射液，上海旭東海普藥業(yè)。

1.1.3 實驗細胞 MCF-7人乳腺癌細胞，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞復蘇成功后，調(diào)整濃度為1×106/ml接種于培養(yǎng)瓶，靜置于37℃、5%CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，用RPMI1640完全培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，隔日換液。待貼壁70% ～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 實驗分組 共分為八組:U組(未處理組)即對照組，LF組為0.1 μmol/L芬太尼處理組，MF組為1 μmol/L芬太尼處理組，HF組為10 μmol/L芬太尼處理組，F(xiàn)U 組為500 μmol/L 5-FU處理組，LF+FU 組為0.1 μmol/L芬太尼與500 μmol/L 5-FU聯(lián)合處理組，MF+FU組為1 μmol/L芬太尼與500 μmol/L 5-FU聯(lián)合處理組，HF+FU組為 10 μmol/L芬太尼與500 μmol/L 5-FU聯(lián)合處理組。

1.2.3 流式細胞法(FCM)檢測亞二倍體峰細胞凋亡情況 取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞濃度約5×105/ml接種于25 ml細胞培養(yǎng)瓶，其貼壁后更換為含不同藥物的培養(yǎng)液(見1.2.2)5 ml，每組5瓶，孵育48 h。屆時吸棄上清，消化、磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，收集細胞(約106/ml以上)于離心管;每管加75%酒精 4 ml，－20℃固定 24 h;4℃低速離心(1500 r/min、5 min)徹底去除酒精，加入 PBS/檸檬酸鹽緩沖液50 μl，室溫放置30 min，間歇振蕩混勻;低速離心，PBS洗滌，振蕩，PI染色，室溫避光放置30 min，流式細胞儀上機檢測。

1.2.4 Western印跡檢測Bcl-2、Bax表達 另取對數(shù)生長期細胞，以5×105/ml接種于25 ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，其貼壁后更換含不同藥物的培養(yǎng)液(見1.2.2)，每組5瓶，孵育48 h。充分裂解，4℃高速離心，取上清－80℃保存。二喹啉甲酸(BCA)法行蛋白質(zhì)濃度測定;煮沸變性、冰浴;蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。分別加入Bcl-2及 Bax一抗、β-actin一抗，4℃孵育過夜。洗膜，加入二抗，室溫2 h。曝光、定影、掃描，軟件分析目的條帶的灰度值及相應β-actin條帶的灰度值，以兩者比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS11.5軟件行單因素方差分析與析因設計方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 凋亡率變化情況 與未處理組相比，單獨應用芬太尼處理時1 μmol/L及10 μmol/L組均引起凋亡率增加(P＜0.01)，單獨應用500 μmol/L 5-FU后凋亡率亦明顯增加(P＜0.01);芬太尼與5-FU聯(lián)合應用，各組較單獨應用5-FU或該濃度芬太尼單獨應用相比，凋亡率均明顯增加，且均具有協(xié)同作用(P＜0.01)。見表1。

2.2 Bcl-2、Bax表達情況 與未處理組相比，單獨應用芬太尼處理1 μmol/L及10 μmol/L組Bcl-2條帶明顯減淺，相對灰度值減小，均引起B(yǎng)cl-2表達減弱(P＜0.01);500 μmol/L 5-FU單獨應用后Bcl-2條帶仍明顯減淺，相對灰度值減小，引起B(yǎng)cl-2表達減弱(P＜0.01);芬太尼與5-FU聯(lián)合應用，各組較單獨應用5-FU或該濃度芬太尼單獨應用相比，Bcl-2條帶亦明顯減淺，相對灰度值減小，且均具有協(xié)同作用(P＜0.05，P＜0.01)。未處理組Bax條帶最淺，相對灰度值最小。與未處理組相比，單獨應用芬太尼處理1 μmol/L及10 μmol/L組Bax條帶明顯加深，相對灰度值增大，均引起 Bax表達增強(P＜0.05，P＜0.01);500 μmol/L 5-FU單獨應用后Bax條帶仍明顯加深，相對灰度值增加，Bax表達增強(P＜0.01);芬太尼與5-FU聯(lián)合應用，各組較單獨應用5-FU或該濃度芬太尼單獨應用相比，Bax條帶亦明顯加深，相對灰度值增加，且均具有協(xié)同作用(P＜0.05，P＜0.01)。見表1。

表1 處理48 h各組細胞凋亡率及Bcl-2、Bax蛋白表達情況(±s，n=5)

表1 處理48 h各組細胞凋亡率及Bcl-2、Bax蛋白表達情況(±s，n=5)

與U組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與相同濃度單用芬太尼組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 細胞凋亡率(%) Bcl-2/β-actin Bax/β-actin U 4.968±0.8102.596±0.4561.054±0.150 LF 5.192±0.5532.544±0.4181.107±0.214 MF 7.460±1.0292) 2.124±0.2842) 1.307±0.2361)HF 9.650±1.8052) 1.920±0.4062) 1.538±0.1542)LF+FU 22.264±2.3312)4)1.261±0.3722)4)1.917±0.2842)3)MF+FU 26.714±2.0062)4)1.141±0.2422)3)2.251±0.2642)3)HF+FU 30.726±3.7622)4)0.815±0.1722)4)2.889±0.2612)4)FU 15.912±1.2782) 1.616±0.3632) 1.604±0.2122)

3 討論

有絲分裂與凋亡之間的平衡對維持體內(nèi)細胞數(shù)量至關重要，腫瘤形成一方面便是基于凋亡的停滯或抑制因而殘留了“未死”細胞群落〔8〕。一般認為，細胞凋亡的抑制比過度增殖在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用更為重要〔9，10〕。很多抗腫瘤藥物通過誘導凋亡使細胞凋亡/增殖比值提高來進行干預性調(diào)節(jié)，芬太尼對抗乳腺癌效應的可能機制之一即是誘導腫瘤細胞凋亡。本研究結果顯示，一定濃度的芬太尼單獨和5-FU單獨應用能顯著誘導MCF-7乳腺癌細胞凋亡，兩藥聯(lián)合應用更顯示出協(xié)同作用。

人類主要有兩種凋亡途徑，即外源性途徑和內(nèi)源性途徑。外源性途徑是由細胞膜表面的死亡受體觸發(fā)，而內(nèi)源性途徑包括Bcl-2家族蛋白調(diào)節(jié)線粒體膜完整性方面的改變，以及對細胞損害或應激信號做出的潛在的反應。Bcl-2家族主宰著一個細胞繼續(xù)存活還是通過線粒體途徑凋亡〔11〕。Bcl-2過量表達有助于腫瘤進展，有助于對標準抗癌療法所誘導凋亡的抵抗。

Bcl-2蛋白水平可被細胞內(nèi)抗Bcl-2單鏈抗體抑制，這在MCF-7乳腺癌細胞及其他癌細胞中體現(xiàn)出藥物誘發(fā)的細胞毒性增加。在本研究中，一定濃度的芬太尼單獨和5-FU單獨應用均可顯著下調(diào)MCF-7乳腺癌細胞Bcl-2表達，兩藥聯(lián)合應用更顯示出協(xié)同作用。有研究也證實，凋亡的發(fā)生與否還有賴于Bcl-2/Bax這對抗凋亡/促凋亡蛋白之間的平衡〔12〕。Bcl-2可穩(wěn)定線粒體膜，防止細胞色素C進入胞質(zhì);而Bax恰恰相反，其滲透到線粒體膜外，容許細胞色素c釋放至胞漿，由此觸發(fā)半胖氨酸蛋白酶(Caspases)級聯(lián)反應引起細胞凋亡〔13〕。本研究提示兩藥聯(lián)合應用可能是依賴線粒體途徑發(fā)揮協(xié)同作用促進細胞凋亡。

1 王志學，孫立新，宋有鑫，等.不同濃度嗎啡與5-氟尿嘧啶聯(lián)合應用對MCF-7乳腺癌細胞增殖凋亡的影響〔J〕.廣東醫(yī)學，2012;33(19):2881-4.

2 王志學，孫立新，李汝泓，等.不同濃度的嗎啡與5-氟尿嘧啶聯(lián)合應用MCF-7乳腺癌細胞凋亡與細胞周期的影響〔J〕.中國老年學雜志，2012;32(15):3223-6.

3 郝振軍，王志學，孫立新，等.不同濃度嗎啡對5-氟尿嘧啶誘導的MCF-7乳腺癌細胞凋亡時Bcl-2、Bax表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2012;32(23):5164-6.

4 王志學，孫立新，李汝泓，等.不同濃度嗎啡與5-氟尿嘧啶聯(lián)合應用對MCF-7乳腺癌細胞Bcl-2、Bax表達的影響〔J〕.實用醫(yī)學雜志，2012;28(20):3441-3.

5 張咸偉，丁漢琳，張傳漢，等.芬太尼對MCF-7細胞增殖和細胞周期影響研究〔J〕.中國醫(yī)師雜志，2005;7(1):23-5.

6 丁漢琳，張咸偉，張傳漢.芬太尼影響MCF-7細胞凋亡的實驗研究〔J〕.實用醫(yī)學雜志，2004;20(12):1351-3.

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8 Pettigrew CA，Cotter TG.Deregulation of cell death(apoptosis):implications for tumor development〔J〕.Discov Med，2009;8(41):61-3.

9 Wu M，Perroud TD，Sivastava N，et al.Microfluidically-unified cell culture，sample preparation，imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution〔J〕.Lap Chip，2012;12(16):2823-31.

10 Clark MJ，Robien K，Slavin JL.Effect of prebiotics on biomarkers of colorectal cancer in humans:a systematic review〔J〕.Nutr Rev，2012;70(8):436-43.

11 Azmi AS，Wang Z，Philip PA，et al.Emerging Bcl-2 inhibitors for the treatment of cancer.Expert Opin Emerg Drugs〔J〕.2011;16(1):59-70.

12 Adams JM，Cory S.The Bcl-2 apoptotic switch in cancer development and therapy〔J〕.Oncogene，2007;26(9):1324-37.

13 Rajendran RR，Kao GD.“No Turning Bax”in the combined battle against prostate cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2007;13(12):3435-8.