冷 冰 馬恩元 薛昊罡 (北華大學(xué)附屬醫(yī)院骨外科，吉林 吉林 132011)

雌激素替代療法預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松在臨床應(yīng)用中已取得較好的療效，但作用機(jī)制尚未明確。目前關(guān)于雌激素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的成骨分化的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在觀察17β-E2對(duì)成年大鼠來(lái)源的MSCs成骨分化的影響，探索雌激素替代治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)機(jī)制，為臨床預(yù)防及治療骨質(zhì)疏松提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 大鼠BMSCs(通過(guò)實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)及擴(kuò)增，鑒定后)，高糖 DMEM(Hyclone，美國(guó))，10%胎牛血清(Hyclone，美國(guó))，0.25%胰酶(Promega，美國(guó))。

1.2 主要儀器 流式細(xì)胞儀 (國(guó)產(chǎn))，由吉林大學(xué)提供;Bio-Rad 550酶標(biāo)儀(EMP恩普，深圳);電子顯微鏡 (日本)。

1.3 大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)及擴(kuò)增 應(yīng)用密度梯度離心法與貼壁篩選法成功分離出MSCs。1月齡雄性大鼠(約100 g)由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。脊髓離斷處死，取雙側(cè)股骨和脛骨，沖洗骨髓腔，經(jīng)Percoll分離液(1.073 g/ml)密度梯度離心后，抽取單個(gè)核細(xì)胞層，用含10%胎牛血清的LDMEM重新懸浮細(xì)胞，以1×106/ml接種于6孔培養(yǎng)板中，24～48 h換液，以后每隔3 d換液，當(dāng)細(xì)胞匯流近80%時(shí)傳代培養(yǎng)，用0.25%胰酶－0.02%EDTA消化，以1∶3比例傳代培養(yǎng)。重復(fù)上述細(xì)胞傳代的操作即可實(shí)現(xiàn)MSCs的有效擴(kuò)增。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs免疫表型 應(yīng)用0.25%胰酶－0.02%EDTA消化收集 BMSCs，分別取 1×106個(gè)細(xì)胞與抗CD44、CD90、CD34及 CD45抗體室溫孵育30 min，0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，滴加FITC標(biāo)記的二抗，避光孵育30 min，0.1 mol/L PBS洗滌2次后懸浮后流式細(xì)胞儀分析。

1.5 BMSCs的生物學(xué)特性 (1)BMSCs生長(zhǎng)曲線測(cè)定:0.25%胰酶－0.02%EDTA消化80%融合狀態(tài)的細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以每孔2×104/ml接種7塊96孔板，100 μl/孔。每天定時(shí)隨機(jī)取出一塊孔板，每孔加入10 μl CCK-8試劑和90 μl含10%FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基(設(shè)5個(gè)平行孔)，同時(shí)設(shè)3個(gè)孔為空白對(duì)照(不加CCK-8)。于37℃、5%CO2孵育2 h后，在Bio-Rad 550酶標(biāo)儀上，在450 nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔的吸光度值(A值)，計(jì)算平均值，繪制生長(zhǎng)曲線。(2)BMSCs細(xì)胞周期的檢測(cè):用0.25%胰酶－0.02%EDTA消化收集細(xì)胞，使其細(xì)胞數(shù)達(dá)到1×106個(gè)/樣本，PBS洗細(xì)胞2次后，加入2 ml 70%乙醇固定;固定后離心去除乙醇，PBS洗滌1次，加入RNase 0.5 ml(5 μg/ml)，37℃消化30 min，PBS 洗滌 1 次，加入 0.5 ml PI(50 μg/ml)，4℃避光染色30 min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 17β-雌二醇對(duì)大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞的影響 (1)成骨誘導(dǎo)液:10－8mol/L 17β-雌二醇，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，50 μg/ml抗壞血酸，含10%FBS的 L-DMEM。(2)誘導(dǎo)方法:6孔板接種1×105個(gè)細(xì)胞/孔，10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)24 h后換用成骨誘導(dǎo)液，每3 d換液，誘導(dǎo)3 w。(3)堿性磷酸酶(ALP)染色:利用ALP試劑盒檢測(cè)ALP表達(dá)。(4)茜素紅染色:細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定10 min后，加入2%茜素紅(pH4.2)染色10 min，充分水洗，鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)及擴(kuò)增 BMSCs細(xì)胞為長(zhǎng)梭形或紡錘形，呈成纖維細(xì)胞樣，核橢圓，可見(jiàn)1～2個(gè)核仁。細(xì)胞匯流達(dá)80%～90%，呈魚群樣或漩渦狀排列。傳代培養(yǎng)的BMSCs生長(zhǎng)旺盛，保持原代細(xì)胞的形態(tài)特征，緊密排列，更加趨向一致，見(jiàn)圖1。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs免疫表型 本實(shí)驗(yàn)選用CD44、CD90、CD34和CD45四種免疫學(xué)標(biāo)志物，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第3代(P3)BMSCs表面標(biāo)志表達(dá)情況。結(jié)果顯示:CD44(基質(zhì)細(xì)胞表達(dá))及CD90(干細(xì)胞表達(dá))為陽(yáng)性，而CD34(造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性)及CD45(白細(xì)胞陽(yáng)性)為陰性。見(jiàn)圖2。

圖1 BMSCs形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)P3 BMSCs表面標(biāo)志

2.3 BMSCs的生物學(xué)特性 BMSCs生長(zhǎng)曲線:P3 BMSCs在最初接種2 d內(nèi)處于生長(zhǎng)潛伏期，在第2～4天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，之后細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，逐漸進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期，平均5～6 d傳代一次(圖3A)。BMSCs細(xì)胞周期:流式細(xì)胞儀測(cè)定P3 BMSCs的DNA含量，分析細(xì)胞周期。結(jié)果顯示，大部分BMSCs細(xì)胞處于靜息期，即G0/G1期的細(xì)胞占84.29%，只有少部分細(xì)胞處于活躍的增殖期，即S+G2/M期的細(xì)胞占15.71%，說(shuō)明我們獲得BMSCs具有干細(xì)胞增殖的特點(diǎn)(圖3B)。

圖3 P3 BMSCs生長(zhǎng)曲線及細(xì)胞周期

圖4 P3 BMSCs成骨誘導(dǎo)過(guò)程中的形態(tài)學(xué)變化

圖5 P3 rMSCs經(jīng)誘導(dǎo)向成骨分化(×100)

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松主要是由卵巢功能衰竭、雌激素缺乏所引起，是原發(fā)性骨質(zhì)疏松中最常見(jiàn)的一種〔1〕。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)50～60歲婦女約30%患絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，60歲以上婦女的患病率為30% ～50%〔2，3〕。BMSCs在骨髓的有核細(xì)胞群中所占含量很低〔4〕，因此要獲得足量的BMSCs，有必要進(jìn)行體外大量擴(kuò)增純化，用于研究和治療。

BMSCs的成骨分化受多種因素的調(diào)節(jié)〔5〕，目前較為肯定的誘導(dǎo)劑包括外源性化學(xué)物、細(xì)胞因子、激素、基因轉(zhuǎn)染和一些物理因素等。雌激素對(duì)BMSCs成骨分化作用的研究結(jié)果不一致，尚有爭(zhēng)議。有的研究證實(shí)17β-E2通過(guò)ERα/β調(diào)節(jié)，上調(diào)骨鈣素的表達(dá)對(duì)促進(jìn)BMSCs成骨分化〔6〕。還有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)E2通過(guò)抑制重要轉(zhuǎn)錄因子核心結(jié)合因子mRNA表達(dá)而減少成骨細(xì)胞生成，且呈劑量依賴性〔7〕。這些研究結(jié)論的不同，可能是由于細(xì)胞來(lái)源、生長(zhǎng)發(fā)育成熟等差異所致。本研究提示了雌激素能通過(guò)增強(qiáng)BMSCs的成骨分化能力來(lái)發(fā)揮促骨形成作用。

自1940年Albright首次應(yīng)用雌激素治療骨質(zhì)疏松至今，在臨床預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松應(yīng)用中取得較好療效。近年來(lái)，雌激素促進(jìn)骨形成方面的研究是骨質(zhì)疏松治療的熱點(diǎn)問(wèn)題。成骨細(xì)胞、BMSCs表面均存在雌激素受體〔8〕，雌激素通過(guò)直接調(diào)節(jié)機(jī)制、旁分泌機(jī)制和細(xì)胞凋亡機(jī)制對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用，維持成骨與破骨效應(yīng)的平衡，調(diào)節(jié)骨的代謝。本研究通過(guò)應(yīng)用17β-雌二醇誘導(dǎo)BMSCs分化為成骨細(xì)胞，為臨床應(yīng)用雌激素治療骨質(zhì)疏松提供了理論根據(jù)。

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8 肖新華.雌激素對(duì)成骨細(xì)胞的作用及作用機(jī)制〔J〕.國(guó)外醫(yī)學(xué)·生理病理科學(xué)與臨床分冊(cè)，2002;226:608.