黃敏 廖春燕

摘要：為探討雞骨草總黃酮的超聲波提取條件及清除自由基的能力，采用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化雞骨草總黃酮的超聲波提取工藝，分別采用水楊酸、鄰苯三酚自氧化法測定雞骨草總黃酮提取液對羥自由基、超氧離子自由基的清除作用。結(jié)果表明，雞骨草總黃酮的超聲波提取最優(yōu)工藝是用25倍70%乙醇浸泡雞骨草粉末，超聲波提取4次，每次18 min，所得提取液總黃酮提取率為1.75%；雞骨草提取液濃度越高，對羥自由基和超氧陰離子的清除作用越大。超聲波提取法適用于雞骨草總黃酮的提取，且提取液對羥自由基和超氧離子自由基具有一定的清除作用。

關(guān)鍵詞：雞骨草；總黃酮；超聲波；自由基

中圖分類號：S567.23+9；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）14-3502-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.14.043

Study on the Ultrasonic Extraction Process and Antioxidant Activity of Total Flavonoids in Abrus cantoniensis L.

HUANG Min1， LIAO Chun-yan2

（1. Food Sciences & Biological Engineering Department ，Guangdong Industry Technical College， Guangzhou 510300，China；

2. Department of Biological and Chemical Engineering ，Guangxi University of Technology， Liuzhou 545006，Guangxi，China）

Abstract： The conditions of ultrasonic extraction of total flavonoids in Abrus cantoniensis L. and its ability of free radical scavenging were investigated. The optimized condition of extraction of total flavonoids was examined through single factor test and orthogonal design. The autoxidation of salicylic acid and pyrogallol was used to assay the abilities of the extract of clearing the free radical of ·OH and ·O2-. The most optimal extracting process was ultrasonic extraction four times with 25 times of 70% ethanol by 18 minutes each time.Under this condition， the amount of the total flavonoids of the extract was 1.75%. And the abilities of the extract of clearing ·OH and ·O2- enhances with the increase of concentration. it is indicated that the method of ultrasonic extraction could be used to determine the total flavonoids in Abrus cantoniensis L.. And the extract of Abrus cantoniensis L. could effectively clear the free radical of ·OH and ·O2-.

Key words： Abrus cantoniensis L.； total flavonoids； ultrasonic extraction； free radical

雞骨草別名紅母雞草、石門坎、黃食草、細葉龍鱗草、大黃草，為豆科植物廣州相思子（Abrus precatorius L.）的干燥全株，全草含相思子堿、膽堿、甾醇化合物、黃酮類、氨基酸、糖類等，具有清熱解毒，舒肝止痛的功效[1]。

黃榮韶等[2]測定了雞骨草中總黃酮的含量，證明雞骨草中含有豐富的黃酮類成分。黃酮是一種很強的抗氧化劑，可有效清除體內(nèi)的氧自由基。張麗丹等[3]利用超聲波乙醇浸提法提取雞骨草中的黃酮類物質(zhì)，得到的提取液用來檢測其清除羥自由基的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞骨草提取液對羥自由基有很好的清除作用；王曉波等[4]采用鄰苯三酚自氧法測定雞骨草對自由基和亞硝酸鹽的清除作用，證明在試驗濃度范圍內(nèi)對超氧陰離子自由基具有清除作用。廣東省有豐富的雞骨草資源，因此，合理開發(fā)廣東省特產(chǎn)的中藥材雞骨草對雞骨草制劑的投放市場具有深刻意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞骨草（市售）；三（羥甲基）氨基甲烷（國藥集團化學試劑有限公司）；蘆丁（中國食品藥品檢定研究院）；水楊酸（天津市福晨化學試劑廠）；焦性沒食子酸（天津市福晨化學試劑廠）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

7230G型可見光分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；T6型新世紀紫外光可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；AB204-N型電子分析天平（上海市梅特勒-托利亨儀器有限公司）；DMF-10A型500克搖擺式高速中藥粉碎機（浙江溫嶺市銘大藥材機械設(shè)備有限公司）；X-150型超聲波細胞粉碎儀（南京先歐儀器制造有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的制定 精確稱取蘆丁標準品10 mg，加 80%乙醇溶解，定容到50 mL容量瓶中搖勻，制成0.2 mg/mL的標準品溶液。分別取該溶液0.0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL于試管中，然后在試管中分別加80%的乙醇5.0、4.8、4.5、4.0、3.0、2.0、1.0 mL，再各加5%亞硝酸鈉0.3 mL搖勻，放置6 min后加10% 硝酸鋁0.3 mL搖勻，15 min后加入1 mol/L氫氧化鈉4.0 mL和0.4 mL去離子水搖勻，放置10 min，在510 nm處測其吸光度。繪制標準曲線，得回歸方程：y=12.655x+0.006 4，R2=0.999 8，表明蘆丁在0.00～0.08 mg/mL有良好的線性關(guān)系。

1.3.2 單因素試驗 參考文獻[2]中的方法，將洗干凈曬干的雞骨草用粉碎機粉碎，過60目篩。稱取雞骨草粉碎2.000 g，加入石油醚（30～60 ℃）浸泡過夜，80 ℃水浴蒸除石油醚，再加50 mL乙醇超聲波提取，用真空抽濾機抽濾，收集濾液，置80 ℃水浴蒸干，用60%乙醇溶解，定容至50 mL。吸取0.5 mL按照標準曲線的方法測定總黃酮含量。對照為吸取相同體積的樣品液，除用0.3 mL 60%乙醇代替10%硝酸鋁溶液外，其余測定方法與正常測定相同。以料液比（g∶mL，下同）、超聲波時間、超聲波次數(shù)、超聲波頻率、乙醇體積分數(shù)為考察對象，對總黃酮含量進行測定。

1.3.3 正交試驗 以單因素試驗中影響雞骨草總黃酮提取率的4個主要因素（料液比、乙醇體積分數(shù)、超聲波時間、超聲波次數(shù)）作為考察因子，設(shè)計了4因素3水平的正交試驗對總黃酮提取工藝進行考察，因素與水平見表1。

1.3.4 提取液抗氧化性能的測定

1）對羥自由基的清除作用。參照文獻[5]中的方法，在25 mL具塞試管中加入2 mL 9 mmol/L FeSO4和2 mL 8.8 mmol/L H2O2，再加入5 mL不同濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL）的樣品溶液，混勻后用9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液定容至刻度。在（37±1） ℃恒溫水浴中反應(yīng)15 min后，在波長510 nm處測定其吸光度Ax，對照組除不加雙氧水外，其他試劑的添加同上。

清除率=1-×100%

式中，A0為對照的吸光度，Ax為不同濃度樣品溶液的吸光度。

2）對超氧離子自由基的清除作用。先將提取物用去離子水配置成濃度不同的梯度，在10 mL的比色管中分別加入4 mL 0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液，置于25 ℃水浴中預熱20 min，然后加入不同濃度（0.016、0.032、0.048、0.064、0.080 mg/mL）樣品液1 mL，再加入在25 ℃水浴中預熱的0.2 mmol/L鄰苯三酚溶液1 mL（鄰苯三酚用0.05 mol/L的鹽酸配制），混勻后在25 ℃水浴中反應(yīng)4 min，立即用兩滴濃鹽酸終止反應(yīng)，并在325 nm處測定吸光度（A樣）。每管做3個重復，取平均值。

同上述過程，只是用1 mL去離子水代替樣液，測定結(jié)果為原始管（A原）。每管做3個重復，取平均值。

清除率=×100%

式中，A原為用去離子水代替樣液的吸光度，A樣為樣品溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比的考察

在乙醇體積分數(shù)為70%，超聲波頻率100 Hz，時間為15 min，超聲波提取3次的條件下，調(diào)節(jié)料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，測得總黃酮的提取率見圖1。由圖1可知，總黃酮的提取率隨著料液比的降低先升高后降低，在1∶30處出現(xiàn)最高峰，故選擇料液比為1∶30。

2.2 超聲波時間的考察

在料液比為1∶30，乙醇體積分數(shù)為70%，超聲波頻率100 Hz，超聲波處理3次的條件下，調(diào)節(jié)超聲時間分別為5、10、15、20、25、30、35、40 min，測得總黃酮的提取率見圖2。由圖2可知，總黃酮的提取率隨著超聲波時間地增加而增加，在15 min處出現(xiàn)最高峰，之后逐漸下降，故選超聲波時間為15 min。

2.3 超聲波次數(shù)的考察

在料液比為1∶30，乙醇體積分數(shù)為70%，超聲波頻率100 Hz，時間為15 min的條件下，分次進行超聲波處理，測得總黃酮的提取率見圖3。由圖3可知，總黃酮的提取率在提取3次處出現(xiàn)最高峰，故選擇超聲波提取次數(shù)為3。

2.4 乙醇體積分數(shù)的考察

在料液比為1∶30，超聲波頻率100 Hz，時間為15 min，處理3次的條件下，調(diào)節(jié)乙醇體積分數(shù)為40%、50%、60%、70%、80%，測得總黃酮的提取率見圖4。由圖4可知，總黃酮的提取率隨著乙醇體積分數(shù)的增大先升高后降低，在70%處出現(xiàn)最高峰，故選擇乙醇體積分數(shù)為70%。

2.5 超聲波頻率的考察

在料液比為1∶30，乙醇體積分數(shù)為70%，超聲波時間為15 min，處理3次的條件下，調(diào)節(jié)超聲波頻率分別為50、100、150、200 Hz，測得總黃酮的提取率見圖5。由圖5可知，總黃酮的提取率隨著超聲波頻率的加大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但上升幅度不大，故在正交試驗中不作為分析因素。

2.6 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲波時間、超聲波次數(shù)對提取率的影響較大，故選擇這4個因素作為正交試驗的因素，正交試驗結(jié)果見表2、表3。由表2和表3可知，對雞骨草中總黃酮提取率的影響由大到小的順序是料液比>超聲時間>乙醇體積分數(shù)>超聲次數(shù)，其中料液比對雞骨草總黃酮提取率的影響具有統(tǒng)計學意義。從直觀分析看出，最優(yōu)水平為A1B1C1D1，在此水平下提取液中總黃酮提取率為1.74%；從k值分析看出，最優(yōu)水平為A2B1C3D3。為得到最佳提取條件，對A2B1C3D3組合做正交驗證試驗，得到總黃酮提取率為1.75%，且重復性好。因此，確定雞骨草總黃酮超聲波提取工藝的最終優(yōu)化方案為用25倍70%乙醇浸泡雞骨草粉末，超聲波提取4次，每次18 min。

2.7 雞骨草提取液對羥自由基的清除作用

由圖6可知，經(jīng)此方法處理得到的雞骨草提取液對羥自由基具有清除作用，且隨著雞骨草提取液濃度的增加，對羥自由基的清除作用就越強，提取液的濃度與清除率具有良好的量效關(guān)系，說明雞骨草提取液中含有的總黃酮對羥自由基有一定的清除作用。

2.8 雞骨草提取液對超氧離子自由基的清除作用

由圖7可知，經(jīng)此方法處理得到的雞骨草提取液具有清除超氧離子自由基的作用，且隨著雞骨草提取液濃度的增加，對超氧離子自由基的清除作用就越強，提取液的濃度與清除率具有良好的量效關(guān)系，說明雞骨草提取液中含有的總黃酮對超氧離子自由基有較好的清除作用。

3 小結(jié)

隨著人們生活品質(zhì)的提高，由黃酮衍生出來的黃酮類保健品、化妝品越來越多。本研究通過采用蘆丁對照、超聲波輔助溶劑提取雞骨草總黃酮并測提取物中總黃酮含量，超聲波提取工藝試驗各因素影響由大到小的順序為料液比>超聲時間>乙醇體積分數(shù)>超聲次數(shù)，經(jīng)過對正交最優(yōu)組合的重復試驗，得出用25倍70%乙醇浸泡雞骨草粉末，超聲波提取4次，每次18 min，總黃酮的提取率為1.75%，且重復性良好。通過采用水楊酸和鄰苯三酚自氧化法證明雞骨草提取液對羥自由基和超氧離子自由基有一定的清除作用。

參考文獻：

[1] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草（四冊）[M].上海：上?？茖W技術(shù)出版社，1999.

[2] 黃榮韶，玉永雄，胡 艷，等.雞骨草總黃酮含量測定及其含量動態(tài)變化研究[J].中國中藥雜志，2006，31（17）：1428-1431.

[3] 張麗丹，羅建華，蒙春越，等.雞骨草總黃酮提取及對羥自由基清除作用[J].微量元素與健康研究，2007，24（2）：44-45.

[4] 王曉波，黃疊玲，劉冬英，等.雞骨草總黃酮清除自由基及抑制亞硝化作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23（4）：942-944.

[5] 廖春燕，楊欣綠.D101型大孔樹脂純化雞骨草總黃酮的工藝優(yōu)選[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（2）：38-40.