戴世鯤　周丹燕　王廣華等

摘要：為了發(fā)展一種將150 kb及以上的外源DNA片段引入變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans）中的有效方法，以大腸桿菌-變鉛青鏈霉菌穿梭細(xì)菌人工染色體為載體，將攜帶完整格爾德霉素生物合成基因簇的3個150～180 kb的外源DNA片段期望以接合轉(zhuǎn)移的方式從大腸桿菌宿主菌（Escherichia coli ET12567/pUZ8002）中橫向轉(zhuǎn)移入變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans）TK23菌株中。結(jié)果表明，接合轉(zhuǎn)移技術(shù)能夠有效地將攜帶完整格爾德霉素生物合成基因簇的3個外源DNA大片段引入到變鉛青鏈霉菌基因組中并穩(wěn)定傳代。

關(guān)鍵詞：接合轉(zhuǎn)移技術(shù)；外源DNA大片段；細(xì)菌人工染色體；變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans）

中圖分類號：R318 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）15-3776-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.051

Abstract： In order to develop an efficient method of transferring 150 kb and above foreign DNA fragments into Streptomyces lividans， intergeneric conjugation technology was utilized to transfer three 150～180 kb foreign DNA fragments， carrying whole geldanamycin biosynthesis gene cluster， into S. lividans TK23 genome， with bacterial artificial chromosome （BAC） of Escherichia coli ET12567/pUZ8002-S. lividans TK23 as vectors. The result showed that all the three foreign DNA fragments were efficiently transferred into S. lividans TK23， and were steadily inherited.

Key words： intergeneric conjugation technology； big foreign DNA fragments； bacterial artificial chromosomes （BAC）； Streptomyces lividans

放線菌是一類革蘭氏陽性菌，能夠產(chǎn)生豐富的具有生物學(xué)活性的次級代謝產(chǎn)物和新穎的抗生素。這些天然產(chǎn)物通常是由大片段生物合成基因簇合成的，例如聚酮合成酶（Polyketide synthase，PKS）和非核糖體多肽合成酶（Nonribosomal peptide synthase，NRPS）。為了分析和操作這些完整的生物合成途徑，異源表達(dá)是一個重要的手段，特別是對于那些沉默的基因簇和天然產(chǎn)物生物合成的基因簇的研究[1]。然而，部分已經(jīng)報道的生物合成基因簇都已超過100 kb，例如rapamycin生物合成基因簇是107 kb[2]、daptomycin生物合成基因簇是128 kb[3]。對這些生物合成基因簇進(jìn)行異源表達(dá)的遺傳操作中，將大片段DNA引入宿主菌鏈霉菌中是其中的關(guān)鍵步驟。一種策略是將生物合成基因簇分配到幾個兼容的質(zhì)粒中，在異源宿主中通過共表達(dá)實(shí)現(xiàn)抗生素的生物合成過程[4]。Zirkle等[5]將soraphen A基因簇分配到2個兼容的質(zhì)粒中，共轉(zhuǎn)化變鉛青鏈霉菌（Streptomyce lividans）原生質(zhì)體，共表達(dá)生物合成化合物。另一種策略是使用細(xì)菌人工染色體（Bacterial artificial chromosome， BAC）載體攜帶完整的抗生素生物合成基因簇。Penn等[3]首次利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法將含有完整的daptomycin生物合成基因簇的BAC質(zhì)粒成功引入變鉛青鏈霉菌中。在放線菌類群中，變鉛青鏈霉菌是異源表達(dá)的重要菌種[6，7]。在本研究中，首次利用接合轉(zhuǎn)移技術(shù)成功地將3個150～180 kb的外源DNA片段引入到變鉛青鏈霉菌中，并得到了穩(wěn)定傳代。這為大片段的生物合成基因簇在變鉛青鏈霉菌中進(jìn)行異元表達(dá)研究和大范圍改造鏈霉菌基因組提供了一種有效的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株、質(zhì)粒以及生長條件和培養(yǎng)基：大腸桿菌（Escherichia coli）使用Luria-Bertani（LB）固體和液體培養(yǎng)基，添加的抗生素濃度為阿伯拉霉素（Apramycin）50 μg/mL、卡那霉素（Kanamycin）25 μg/mL、氯霉素（Chloramphenicol）12.5 μg/mL。大腸桿菌ET12567/pUZ8002菌株作為變鉛青鏈霉菌TK23菌株接合轉(zhuǎn)移的供體菌。變鉛青鏈霉菌菌株以MS為固體培養(yǎng)基，在28 ℃培養(yǎng)。載體pBAC-1003是一個16 kb的大腸桿菌和變鉛青鏈霉菌的穿梭BAC載體，組成元件包括φC31 int、attP、oriT和阿伯拉霉素抗性基因[aac（3）Ⅳ]。3個BAC質(zhì)粒pH4E9、pH19H10和pH22H5分別以pBAC-1003為載體，插入片段覆蓋完整的格爾德霉素（Geldanamycin）生物合成基因簇，脈沖場凝膠電泳（Pulsed field gel electrophoresis，PFGE）顯示插入片段分布為150～180 kb（圖1）。2×YT培養(yǎng)基（1 L培養(yǎng)基加16 g Difco Bacto tryptone，10 g Difco Bacto yeast extract，5 g NaCl），AS-1培養(yǎng)基（1 L培養(yǎng)基加1 g yeast extract，0.2 g L-alanine，0.2 g L-arginine， 0.5 g L-asparagine，5 g soluble starch，2.5 g NaCl，10 g Na2SO，20 g agar， pH 7.5）和MS（Mannitol soya flour）培養(yǎng)基（1 L培養(yǎng)基加20 g mannitol，20 g soya flour，20 g agar）用于準(zhǔn)備變鉛青鏈霉菌孢子和接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基。

1.2 大片段BAC質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移

質(zhì)粒pBAC-1003、pH4E9、pH19H10和pH22H5分別被電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ET12567/pUZ8002菌株中。與變鉛青鏈霉菌TK23菌株的接合轉(zhuǎn)移根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法[8]稍作修改，具體步驟：①供體菌大腸桿菌ET12567/pUZ8002菌株接種于LB培養(yǎng)基，在37 ℃搖床中培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6。②離心收集細(xì)胞，用等體積的LB液體培養(yǎng)基洗2次，最后懸浮于0.1倍體積的LB培養(yǎng)基中。③從MS平板上刮取收集變鉛青鏈霉菌孢子，并懸浮于2×YT培養(yǎng)基中，制成濃度為108個孢子/500 μL的孢子懸液，50 ℃熱激10 min預(yù)萌發(fā)。④將500 μL大腸桿菌供體菌懸液加入準(zhǔn)備好的500 μL孢子液中，混合物涂布在AS-1培養(yǎng)基平板上，平板中添加MgCl2至終濃度為10 mmol/L。⑤平板28 ℃培養(yǎng)16～20 h后，每個平板的表面覆蓋含有0.5 mg萘啶酮酸（Nalidixic acid）、1 mg阿伯拉霉素和1 mL水的混合物。平板在28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6 d。⑥將平板上長出的菌落（疑是陽性接合子）在MS培養(yǎng)基平板上劃線轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)基中添加25 μg/mL萘啶酮酸和50 μg/mL阿伯拉霉素。

1.3 變鉛青鏈霉菌TK23陽性接合子的PCR驗(yàn)證

采用PCR方法驗(yàn)證陽性接合子基因組中的外源DNA片段，即攜帶格爾德霉素生物合成基因簇的BAC質(zhì)粒。在添加阿伯拉霉素和萘啶酮酸的MS平板上劃線培養(yǎng)3代之后，提取陽性接合子基因組DNA。3對特異性引物用于聯(lián)合檢測陽性接合子，其中兩對為格爾德霉素基因簇的特異性引物，擴(kuò)增區(qū)域分別是格爾德霉素生物合成基因簇的聚酮合成酶（PKS）第一個酮基合成酶（KS）域GdmKS1基因（forward：5′-GGTGTCGGGTTGGTGTTGCTG-3′， reverse：5′-GCTGACGCCGAAGGAGGAGATT-3′）和后修飾區(qū)域的GdmRI基因（forward：5′-GCTGACCGTGATGTAGAGGC-3′，reverse：5′-AGCGGTATCTGTGCTTCCTG-3′），這兩個基因分別位于格爾德霉素基因簇前端和末端[9]；第三對引物為阿伯拉霉素抗性基因的特異性引物Apr（Apr_1：5′-CAGTTGACCCAGGGCTGTC-3′，Apr_2：5′-GCAATACGAATGGCGAAAA-3′）。PCR反應(yīng)采用Ex Taq聚合酶（TaKaRa），陽性接合子的基因組DNA作為模板。PCR反應(yīng)程序：94 ℃變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物TA克隆至pMD18-T載體中，進(jìn)一步測序驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 變鉛青鏈霉菌TK23菌株陽性接合子的驗(yàn)證

以格爾德霉素原始產(chǎn)生菌的基因組DNA作為陽性對照，變鉛青鏈霉菌TK23受體菌的基因組DNA作為陰性對照。3個BAC質(zhì)粒的變鉛青鏈霉菌TK23陽性接合子基因組DNA使用GdmKS1基因和GdmRI基因的兩對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增均能得到目標(biāo)條帶（圖2），測序結(jié)果證實(shí)序列正確。同時阿伯拉霉素抗性基因的特異性引物Apr對陽性接合子的PCR擴(kuò)增條帶和測序結(jié)果均正確（圖3）。3對聯(lián)合檢測的特異性引物的PCR結(jié)果表明接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)是成功的。

2.2 大片段BAC質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移效率

3個BAC質(zhì)粒通過接合轉(zhuǎn)移進(jìn)入變鉛青鏈霉菌TK23受體菌后，BAC質(zhì)粒在int基因的表達(dá)產(chǎn)物整合酶的作用下整合到受體菌基因組中。大片段BAC質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移效率（陽性接合子數(shù)除以變鉛青鏈霉菌受體菌孢子數(shù)）對于插入片段的長度具有一定的敏感性。3個插入片段為150～180 kb的BAC質(zhì)粒與空載BAC質(zhì)粒相比，接合轉(zhuǎn)移的效率明顯降低（圖4），空載BAC質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移效率為1.1×10-3，3個BAC質(zhì)粒pH4E9、pH19H10和pH22H5的接合轉(zhuǎn)移效率分別為2.5×10-6、3.8×10-6和7.3×10-7，比空載BAC質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移效率低103個數(shù)量級。BAC質(zhì)粒pH22H5的插入片段最大（約180 kb），因而其接合轉(zhuǎn)移效率也是最低的。

3 討論

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化是經(jīng)典的鏈霉菌基因轉(zhuǎn)移方法，但是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的試驗(yàn)操作復(fù)雜，包括原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化后細(xì)胞的再生，外源DNA易受到原生質(zhì)體制備過程中產(chǎn)生的胞外核酸酶的作用而降解，整個試驗(yàn)過程難以控制。與原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化相比，接合轉(zhuǎn)移的試驗(yàn)過程較簡單，可避開胞外核酸酶的降解作用，同時還可克服鏈霉菌對外源DNA的限制性障礙，目前已在多個種屬的鏈霉菌中成功使用。

接合轉(zhuǎn)移供體菌常選擇大腸桿菌ET12567菌株，它是一種甲基化缺陷型菌株，可有效地避免一些鏈霉菌種屬中甲基化修飾限制系統(tǒng)的作用。接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒載體一般為大腸桿菌和鏈霉菌的穿梭載體。在接合轉(zhuǎn)移過程中，穿梭載體在pUZ8002的輔助下進(jìn)入鏈霉菌菌株中。外源DNA在穿梭載體上int基因表達(dá)的產(chǎn)物整合酶作用下，載體中的attP序列與鏈霉菌基因組中的attB序列發(fā)生特異性重組，將穿梭載體及其攜帶的外源DNA整合到鏈霉菌基因組中。

目前，接合轉(zhuǎn)移技術(shù)常用于鏈霉菌的基因敲除和基因回補(bǔ)[10]，多是10 kb以下短片段，用于cosmid載體也有報道，但大片段BAC質(zhì)粒則少有報道。本研究首次利用接合轉(zhuǎn)移技術(shù)將3個150～180 Kb的外源DNA片段引入變鉛青鏈霉菌中，這一方法擴(kuò)展了在鏈霉菌異源宿主中運(yùn)送大片段外源DNA的遺傳操作技術(shù)，有助于對鏈霉菌代謝工程和合成生物學(xué)的研究。這項(xiàng)研究結(jié)果暗示在自然環(huán)境中微生物菌株間的大片段DNA橫向轉(zhuǎn)移具有一定的可能性，而這種可能性是抗生素生物合成途徑進(jìn)化理論的假說之一。

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